陳陽霞 顧桉菁 梁宇恒 馬團 席麗艷

(1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院，廣州 510120;2.貴陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴陽 550004)

馬爾尼菲青霉是一種雙相型真菌，室溫培養(yǎng)時以菌絲形態(tài)生長，37℃培養(yǎng)或感染人體后以酵母細胞形態(tài)生長，感染人體后可引起一種嚴重的深部真菌病，該病在免疫受損患者尤其是HIV感染患者中多見［1］。有研究表明，馬爾尼菲青霉的致病性與acuD、hsp 70和hsp 90等基因有關［2-4］。通過克隆目的基因并將其連接到真核表達載體，轉化入真核細胞，是研究真核細胞基因功能常用的方法。絲狀真菌常用的轉化方法有原生質體法、醋酸鋰法、農桿菌介導法、電穿孔法和生物彈道技術等。其中最常用的是原生質體法，關鍵是要用蝸牛酶、纖維素酶等消化細胞壁。但是制備原生質體時，因不同時間配制的酶解液在濃度或性能上有所差異，導致原生質體的形成速度不同，所以每次制備過程都需多次觀察且不容易控制。利用生物彈道技術轉化，則首先要用鎢對質粒DNA進行包裝，再通過高速離子轟擊將其轉化入孢子和菌絲［5］。直接使用萌發(fā)孢子進行電穿孔轉化，則不需制備原生質體。電穿孔轉化法原理是瞬時電擊導致細胞膜形成可逆的通透性，形成微孔通道，從而使質粒DNA進出細胞獲得轉化［6］。有研究表明，電穿孔轉化法轉化率較原生質體法高，且大部分轉化子都是單拷貝，在基因組隨機分配，更適合絲狀真菌的轉化［7］。該方法已在多種絲狀真菌中得到應用，如煙曲霉、構巢曲霉、黑曲霉等［8］。在本研究中，直接使用萌發(fā)的馬爾尼菲青霉孢子進行電穿孔轉化，從孢子齡、孢子萌發(fā)時間、質粒濃度和電場強度等方面考察各個因素對電穿孔轉化效率的影響，期望得到關于馬爾尼菲青霉高效轉化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和載體 馬爾尼菲青霉缺陷株SPM4(pyrG-，niaD-)和質粒pALX223(克隆含構巢曲霉pyrG基因)均為北京大學醫(yī)學真菌和真菌病研究中心惠贈。

培養(yǎng)基 培養(yǎng)攜帶質粒pALX223的重組大腸桿菌 (Escherichia coli)DH5α，使用含 100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。真菌培養(yǎng)基:PDA+U培養(yǎng)基，EP+U培養(yǎng)基、SDB液體培養(yǎng)基、蔗糖SD培養(yǎng)基和SD培養(yǎng)基。具體配制方法參考文獻［9］。

主要試劑 內切酶XhoI和BamHI購自Thermo Scientific公司、質粒中提試劑盒購自Promega公司、大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根公司。

主要儀器 Eppendorf高速冷凍離心機、Leica DM2500相差顯微鏡和成像系統(tǒng)、Bio-Rad gene pulser II電穿孔儀等。

1.2 質粒的提取、酶切和回收

使用含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基復蘇和擴大培養(yǎng)攜帶質粒pALX223的重組大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α。將擴大培養(yǎng)的菌液按照Promega公司質粒中提試劑盒說明書 (編號CTM253)依次經過裂解產物制備、DNA純化、洗滌、洗脫等步驟提取質粒并測OD值;取適量質粒按Thermo Scientific公司內切酶XhoI和BamHI說明書制備酶切體系;最后按照北京天根公司大量瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒說明書 (目錄號DP210)依次經過跑膠、切膠、溶膠等步驟對酶切后目的DNA進行回收。

1.3 感受態(tài)孢子的制備

用無菌水從PDA+U斜面上洗下26℃培養(yǎng)一定天數的SPM4孢子，接種于EP+U培養(yǎng)基，使孢子濃度達到106個/mL，于37℃，150 r/min條件下培養(yǎng)一定時間使孢子萌發(fā)，期間每隔1 h收集部分孢子懸液并取樣顯微鏡觀察孢子形態(tài)，將各個時間點收集的孢子懸液用冰預冷1M山梨醇洗滌3次制備感受態(tài)孢子并將其調整至107個/mL，置冰上備用。

1.4 轉化

冰上取60 μL SPM4感受態(tài)孢子懸液，加入一定量的質粒DNA和無菌水，使終體積為70 μL，同時設一組不加質粒DNA的陰性對照?；旌衔镌诒戏胖?5 min后轉入0.2 cm電擊杯中，在一定電場強度下電擊。電擊后立即加入930 μL 1M冰預冷山梨醇，冰上放置30 min后加入2 mL SDB液體培養(yǎng)基，37℃，150 r/min培養(yǎng)90 min。離心去上清(留100 μL)涂布于蔗糖SD培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)5～7 d后挑取生長出的單菌落進行純化。

1.5 轉化子的篩選和純化

使用SD培養(yǎng)基進行篩選和純化。挑取單菌落點種SD培養(yǎng)基進行產孢培養(yǎng)，無菌水洗下相應轉化子的孢子，稀釋后涂布于上述篩選平板，挑取單菌落再進行第二次產孢培養(yǎng)和稀釋涂布。若該單菌落兩次產孢培養(yǎng)均可正常生長，則將其所對應的轉化子記為陽性轉化子，余記為陰性。具體方法參考文獻［10］。

1.6 統(tǒng)計學處理

考察孢子齡、孢子萌發(fā)時間、質粒濃度、電場強度和質粒線性化對電轉化效率影響時，各個組合進行3次生物學重復，使用Microsoft Excel記錄各個組合各次實驗的陽性轉化子數并將其導入Graph-Pad Prism 5軟件制圖，數據描述以均數±標準差表示，使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組均數比較采用 Student＇s t-test(*.P＜0.05;＊＊.P＜0.01)。

2 結 果

2.1 孢子齡對轉化率的影響

收集培養(yǎng)5～9 d的SPM4孢子。其他條件為:孢子萌發(fā)時間 4 h;電場強度 5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質粒1 μg。由圖1知，當孢子齡為6 d時，獲得的轉化子數達到峰值，使用培養(yǎng)6 d的孢子可獲得最高的轉化率。

2.2 孢子萌發(fā)時間對轉化率的影響

收集培養(yǎng)6 d的SPM4孢子，光鏡下觀察不同時間的孢子形態(tài)，由圖2知，隨著萌發(fā)時間的增加，孢子有逐漸聚集的趨勢，3 h部分孢子開始萌發(fā)，4 h孢子基本萌發(fā)，5 h部分孢子已有菌絲生成和聚集。其他條件為:電場強度 5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質粒1 μg。由圖3知，當孢子萌發(fā)4 h，獲得的轉化子數達到峰值，使用萌發(fā)4 h的孢子能獲得最高的轉化率。

2.3 電場強度對轉化率的影響

在4.0～7.5 kV/cm范圍內利用不同的電場強度電擊［7，11］，觀察其對馬爾尼菲青霉轉化率的影響。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;環(huán)狀pALX223質粒1 μg。由圖4知，使用5 kV/cm的電場強度可獲得最高的轉化效率。

2.4 質粒量對轉化率的影響

利用不同量的環(huán)狀pALX223質粒DNA對SPM4進行轉化。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;電場強度5 kV/cm。由圖5知，轉化子數隨質粒量的增加而增加，當加入質粒量達到1 μg時，轉化子數增加趨勢趨于平緩，加入質粒量增加至2 μg時轉化子數基本不再增長，加入1～2 μg的質粒DNA可獲得較高的轉化效率。

2.5 質粒線性化對轉化率的影響

分別使用1 μg環(huán)狀或線性化pALX223質粒DNA轉化SPM4，以研究質粒線性化對轉化率的影響。其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;電場強度5 kV/cm。由圖6知，使用環(huán)狀pALX223質粒DNA平均獲得轉化子21個，而使用XhoI和BamHI酶切線性化的pALX223質粒DNA平均獲得轉化子13個，環(huán)狀質粒較線性化質粒轉化率高(＊＊.P＜0.01)。

圖1 孢子齡對SPM4轉化率的影響(其他條件為:孢子萌發(fā)時間4 h;電場強度5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質粒1 μg) 圖2 不同萌發(fā)時間SPM4孢子光鏡下形態(tài)(400×) 圖3 孢子萌發(fā)時間對SPM4轉化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;電場強度5 kV/cm;環(huán)狀pALX223質粒1 μg) 圖4 電場強度對SPM4轉化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;環(huán)狀pALX223質粒1 μg) 圖5 質粒量對SPM4轉化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;電場強度5 kV/cm) 圖6 環(huán)狀或線性化質粒對SPM4轉化率的影響(其他條件為:孢子齡6 d;孢子萌發(fā)時間4 h;電場強度5 kV/cm)。注:柱狀圖中柱形代表3次獨立實驗的平均值 (＊＊.P＜0.01)Fig.1 Effect of spore stadium on transformation frequency of SPM4.Other conditions:germination time 4 h，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.2 Microscopic morphology of germinated spores of SPM4 at different time(400 × )Fig.3 Effect of germination time on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，electric field intensity 5 kV/cm and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.4 Effect of electric field intensity on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and circular plasmids pALX223 1 μg Fig.5 Effect of plasmid amount on transformation efficiency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm Fig.6 Effect of circular or linearized plasmids on transformation frequency of SPM4.Other conditions:spore stadium 6 d，germination time 4 h and electric field intensity 5 kV/cm.The bars are representative of the mean values of three independent experiments.Statistical significance was determined by Student＇s t-test(＊＊.P ＜ 0.01)

3 討 論

通過對影響轉化率的幾個主要因素的研究，發(fā)現適合SPM4電穿孔轉化條件為:孢子齡為6d，孢子萌發(fā)時間為4 h，電場強度為5 kV/cm。在上述條件下分別使用1 μg環(huán)狀或線性化質粒pALX223 DNA進行轉化，平均可以得到21個和13個轉化子。當孢子齡為6 d時獲得的轉化子數達到峰值，可能是該時間段的孢子較新鮮且豐富，萌發(fā)能力較強適合轉化。結合不同萌發(fā)時間的孢子形態(tài)及相應的轉化率進行分析，當SPM4的孢子萌發(fā)時間為0 h時轉化率為0可能是由于SPM4轉化效率本身極低，萌發(fā)時間為0 h時的孢子具有較厚的細胞壁，電穿孔很難形成微孔通道使質粒DNA進入細胞完成轉化。隨著萌發(fā)時間增加，轉化率隨著萌發(fā)時間的增加而上升，可能是由于萌發(fā)孢子為適應菌絲生成，體積逐漸變大而細胞壁厚度相應降低，從而有利于轉化。當萌發(fā)時間為5 h時轉化率急劇下降可能是由于菌絲的生成和聚集。轉化率先隨著電場強度的加大而上升，但當電場強度大于5 kV/cm時，轉化率反而下降，可能是過高的電場強度導致大量孢子死亡。在電穿孔過程中，電場強度偏低會導致細胞不宜極化產生微孔通道，造成質粒DNA不能進入細胞，無法完成轉化;而電場強度過高，會導致大部分細胞產生較大的孔洞，不易復原而死亡，從而降低了細胞的存活率，也影響了轉化率［12］。質粒量過多或過少均影響轉化率?？赡苁钱斮|粒量過少時，質粒DNA太少不足以產生高轉化效率［13］;而當質粒量增大超過閾值時，細胞能吸收的質粒DNA達到飽和，繼續(xù)增加質粒量也不會增加轉化效率。相關原因仍需進一步研究，是否高濃度的質粒DNA影響了細胞表面的電位變化或是封閉了DNA進入的通道還有待考察［14］。本研究發(fā)現針對SPM4的萌發(fā)孢子，環(huán)狀質粒較線性化質粒轉化效率高，這與袁錫華的研究結論一致［9］。但本研究的前提是SPM4產孢能力較強，對于不產孢或產孢能力弱的菌株則不適用。

由于文獻中可循的馬爾尼菲青霉成功電轉參數極少，本研究參考黑曲霉、釀酒酵母和大腸桿菌電穿孔轉化相關文獻［10，12-13］，通過限定部分電轉參數來一一摸索各因素較優(yōu)化的水平，建立了高效、簡便的馬爾尼菲青霉電穿孔轉化體系，滿足后續(xù)馬爾尼菲青霉基因功能研究的需求。因此認為該方法在本實驗中同樣適用。本研究沒有采用多因素多水平交互式表格設計是因為其實驗設計復雜，所需樣本量極大，誤差也極大，且需要耗費大量時間和費用。

電穿孔轉化方法具有快速、簡單、易于操作、重復性好和轉化效率高等特點，比原生質體法更適合馬爾尼菲青霉的轉化。馬爾尼菲青霉電穿孔轉化體系的建立和優(yōu)化為其基因功能研究提供了良好的平臺。

4 致 謝

感謝北京大學醫(yī)學真菌和真菌病研究中心惠贈菌株和質粒。

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