鄭永紅，陳群，朱德曉，張世袍

血漿同型半胱胺酸水平和5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的相關(guān)性研究

鄭永紅，陳群，朱德曉，張世袍

目的：探討血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平及5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因多態(tài)性與原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系。

方法:選擇原發(fā)性下肢深靜脈血栓患者220例（病例組）和同期對(duì)照者240例（對(duì)照組），收集年齡、性別和體重等臨床資料，測(cè)定空腹血糖、血清總膽固醇、纖維蛋白原和D二聚體等生化指標(biāo)，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿Hcy水平，并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性的分析。兩組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、空腹血糖和血清總膽固醇差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），病例組纖維蛋白原、D-二聚體和血漿Hcy值高于對(duì)照組（P＜0.05）。

結(jié)果: MTHFR TT 基因型在病例組的分布頻率為16.8%高于對(duì)照組6.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病例組CT基因型、TT基因型與CC 基因型相比血漿Hcy 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在對(duì)照組中只有TT基因型與高于CC 基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。無論是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例組的血漿 Hcy 水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。

結(jié)論:血漿高Hcy水平是原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的危險(xiǎn)因素。MTHFR C677T基因多態(tài)性中TT 基因型可能是原發(fā)性下肢深靜脈血栓形成的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)遺傳因子。

下肢深靜脈血栓形成；同型半胱胺酸；5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:209.)

同型半胱氨酸( Hcy )是一種含巰基的氨基酸,是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物。在Hcy代謝過程中，5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是其代謝途徑中的關(guān)鍵酶，MTHFR 基因第677位C→T 突變（MTHFR C677T）可以導(dǎo)致血漿Hcy的水平改變[1]。近來研究表明，高同型半胱氨酸血癥是中國(guó)人的心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2、3]。MTHFR 基因多態(tài)性也與心腦血管[4]和外周血管疾病[5]密切相關(guān)，但MTHFR基因是否完全通過影響Hcy的水平起作用至今機(jī)制未明[6]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為輕、中度升高的血漿同型半胱氨酸水平與深靜脈血栓成正相關(guān)。然而對(duì)于MTHFR基因多態(tài)性與靜脈血栓的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不一。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于原發(fā)性深靜脈血栓與Hcy及MTHFR C677T 基因相關(guān)性的系統(tǒng)研究尚少。本研究目的旨在探討血漿Hcy水平及MTHFR C677T 基因多態(tài)性與中國(guó)南方漢族人原發(fā)性下肢深靜脈血栓的關(guān)系，進(jìn)一步了解原發(fā)性深靜脈血栓形成的主要危險(xiǎn)因素。

1 資料與方法

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：病例組：2008-07至2012-06因原發(fā)性下肢深靜脈血栓入住福建省立醫(yī)院的患者220例，其中男114例，女106例，年齡42～78歲，平均(67±13)歲，均為福建漢族人。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)血管外科分會(huì)制定的深靜脈血栓診治指南，并且經(jīng)下肢深靜脈血管造影檢查證實(shí)靜脈血栓存在，排除嚴(yán)重心腦血管及肝腎疾病、惡性腫瘤、骨折、近期手術(shù)、妊娠、長(zhǎng)期激素治療等繼發(fā)性因素所致的血栓形成，以及近一周內(nèi)應(yīng)用抗凝藥及其他部位血栓病史者。對(duì)照組：選取同期在我院體檢中心年齡、性別和體重構(gòu)成相匹配的健康體檢者240例，其中男127例，女113例，年齡40～76歲，平均(66±15)歲。測(cè)定病例組及對(duì)照組體質(zhì)指數(shù)、空腹血膽固醇、空腹血糖、纖維蛋白原及D二聚體，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）于酶聯(lián)儀測(cè)定血漿Hcy 水平（Hcy試劑盒購(gòu)自浙江大學(xué)生科生物技術(shù)有限公司）[7]。兩組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)指數(shù)、血膽固醇和空腹血糖值上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血纖維蛋白原、D-二聚體和血漿Hcy值在病例組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。（表1）

表1 兩組基本臨床資料比較（±s）

表1 兩組基本臨床資料比較（±s）

注：與對(duì)照組比較 *P＜0.05

項(xiàng)目 對(duì)照組(n=240) 病例組(n=220)年齡 (歲) 65.6±15.3 67.3±12.6性別(男/女 ) 127/113 114/106體質(zhì)指數(shù) (kg/m2) 21.8±3.6 23.1±3.8空腹血膽固醇 (mmol/L) 4.89±0.8 4.72±1.1空腹血糖 (mmol/L) 4.85±0.8 5.04±0.9纖維蛋白原 (mmol/L) 3.24±0.9 3.76±1.4 *D-二聚體(mmol/L) 0.35±0.3 15.5±0.7 *同型半胱胺酸 (μ mol/L) 10.15±4.6 14.98±7.0*

基因型檢測(cè)：脫氧核糖核酸（DNA）提取試劑盒提取各組外周靜脈血白細(xì)胞DNA，并用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)法檢測(cè)基因型。MTHFR基因型上游引物：5’-GTGTGGGAGCTTGGAGCAAT-3’,下游引物：5’-GAAAAGCTGCGTGATGATGA-3’。 聚 合 酶 鏈反應(yīng)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。取PCR產(chǎn)物，3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像，并經(jīng)基因測(cè)序明確基因型。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各組病例和對(duì)照組的性別、基因型及等位基因頻率。組間基因型及等位基因頻率用卡方檢驗(yàn)。均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

基因多態(tài)性分析：MTHFR基因的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物為369 bp，可被酶切產(chǎn)生193 bp、112 bp、64 bp三個(gè)片段。位于第677位堿基存在C-T突變，當(dāng)?shù)?77位堿基突變?yōu)門時(shí)，193 bp片段可進(jìn)一步被酶切成165 bp和28 bp。28 bp太小，易跑出瓊脂糖。故存在193 bp、112 bp、64 bp條帶為CC型，存在165 bp、112 bp、64 bp條帶則為TT型，193 bp、165 bp、112 bp、64 bp四個(gè)條帶同時(shí)存在則為CT型（圖1）。兩組人群基因型分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinberg平衡，因此具有人群代表性。MTHFR TT 基因型在病例組的分布頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。TT 基因型與下肢深靜脈血栓顯著相關(guān)（比值比：2.77，P＜0.05）。

表2 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型分布頻率比較 [例（%）]

不同 MTHFR 基因型血漿Hcy 水平的比較 ：無論是CC基因型、CT基因型或TT基因型，病例組的血漿Hcy 水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。病例組CT基因型、TT基因型與本組CC 基因型相比血漿Hcy水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在對(duì)照組中只有TT基因型與高于本組CC 基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型血漿同型半胱氨酸水平比較 （μ mol/L±s)

表3 兩組不同5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型血漿同型半胱氨酸水平比較 （μ mol/L±s)

注：與對(duì)照組比較 *P＜0.05；與本組CC基因型比較 △P＜0.05。余注見表2

MTHFR基因型 對(duì)照組(n=240) 病例組(n=220)CC 9.08±4.7 12.08±6.9*CT 11.31±4.5 17.16±7.6*△TT 14.15±3.5△ 19.02±5.3 *△

3 討論

下肢深靜脈血栓形成是一種發(fā)病率很高的周圍血管疾病，近年來在我國(guó)有一個(gè)較快上升的勢(shì)頭。原發(fā)性深靜脈血栓形成是排除繼發(fā)因素的原發(fā)性血栓性疾病，主要與遺傳和環(huán)境相關(guān)。Hcy可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血栓形成，是血液高凝狀態(tài)形成的重要原因之一。Gatt等[8]認(rèn)為高Hcy是靜脈血栓性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本組研究結(jié)果顯示，病例組Hcy 水平明顯高于對(duì)照組，證實(shí)了Hcy與原發(fā)性深靜脈血栓形成關(guān)系密切，高Hcy是原發(fā)性血栓性疾病的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因子。

血中Hcy水平升高主要受遺傳和營(yíng)養(yǎng)因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的突變是引起Hcy改變的主要遺傳因素，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系[9]，它的多態(tài)性可以通過影響酶的活性而影響血漿Hcy水平。另有學(xué)者認(rèn)為它也可通過MTHFR酶直接影響內(nèi)皮的功能，從而是心血管疾病的獨(dú)立的影響因子，而不依賴于高Hcy產(chǎn)生效用[6]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥的相關(guān)性文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不一，甚至相反。于海東等[10]和Yin等[11]報(bào)道MTHFR的TT基因型在靜脈血栓組的分布頻率高于對(duì)照組, MTHFR C677T多態(tài)性中TT基因型可能是深靜脈血栓形成的一個(gè)遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。但有些學(xué)者認(rèn)為MTHFR基因C677T突變并不是靜脈血栓栓塞癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[12、13]。造成結(jié)論不一的原因，考慮可能與MTHFR C677T的種族、地域分布差異有關(guān)，也可能與樣本量及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)TT基因型在原發(fā)性深靜脈血栓的分布頻率高于對(duì)照組。進(jìn)一步研究表明，中國(guó)南方漢族人中，無論是CC 基因型、CT 基因型或TT 基因型，病例組的Hcy水平均明顯高于對(duì)照組，提示了高Hcy血癥可能是導(dǎo)致下肢深靜脈血栓發(fā)病的重要因素之一。在病例組中CT 基因型與CC 基因型相比、TT 基因型與CC基因型相比Hcy 水平均升高，差異有顯著意義，而在對(duì)照組中只有TT 基因型與CC 基因型相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示TT 基因型突變與高Hcy血癥有著密切關(guān)系。目前國(guó)內(nèi)外更多的研究靜脈血栓栓塞癥與上述兩者的關(guān)系中包含許多繼發(fā)性因素如：骨折手術(shù)與制動(dòng)、癱瘓或長(zhǎng)期臥床、長(zhǎng)期使用雌激素、惡性腫瘤、妊娠、口服避孕藥和心腦血管及肝腎疾病等，都對(duì)研究造成一定影響。而我們的研究選擇的人群為單純的原發(fā)性下肢深靜脈血栓的患者，且均經(jīng)下肢靜脈造影明確診斷，排除了許多繼發(fā)性的因素的干擾，同時(shí)校正了高膽固醇和高血糖兩個(gè)可能影響結(jié)果的因素。我們推測(cè)，MTHFR基因通過第677位C→T突變引起血漿Hcy水平增高，從而參與下肢深靜脈血栓的發(fā)病過程，我們認(rèn)為MTHFR TT基因型突變可能是引起下肢深靜脈血栓患者高Hcy 血癥的重要遺傳因素，這與凱麗比努爾[14]的看法一致，即TT基因型仍然主要通過影響Hcy的水平來影響血栓的形成。而與凱麗比努爾看法不同之處在于我們認(rèn)為MTHFR基因C677T多態(tài)性可能是下肢深靜脈血栓形成的一個(gè)獨(dú)立的重要的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子。

原發(fā)性下肢深靜脈血栓發(fā)病是多因素參與的病理過程，也許將來可以通過篩查MTHFR 基因來預(yù)測(cè)部分人群的靜脈血栓形成。當(dāng)然目前尚待大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)來證實(shí)這一方法的可行性。由此通過提高這類疾病的診治水平，從而改善其預(yù)后。

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Relationship Between Homocysteine Level, 5, 10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Gene Polymorphism With Primary Lower Extremity Deep Venous Thrombosis Formation

ZHENG Yong-hong, CHEN Qun, ZHU De-xiao, ZHANG Shi-pao.
Department of Cardiology, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou (350001), Fujian, China

ZHENG Yong-hong, Email: zhengyongh@21cn.com

Objective: To explore the relationship between homocysteine (Hcy) level, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene polymorphism with primary lower extremity deep venous thrombosis (LEDVT) formation.

Methods: Our research included 2 groups, LEDVT group, n=220 patients and Control group, n=240 healthy subjects with the matched age, gender and body weight. The fasting blood glucose (GLU), total cholesterol (TC), fi brinogen (Fng)and D-dimer were determined, plasma Hcy level was measured by ELISA, MTHFR polymorphisms were detected by PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in both groups.

Results: The age, gender, BMI, GLU and TC levels were similar between 2 groups, P>0.05 and the Fng, D-dimer and Hcy levels were higher in LEDVT group than those in Control group, P<0.05. The distribution frequency of MTHFR TT genotype was higher in LEDVT group than Control group, 16.8% vs 6.7%, P<0.05. The patients with genotypes of CT, TT and CC in LEDVT group had the higher Hcy level than those in Control group, P<0.05. While in Control group,the TT genotype had the higher Hcy level than that in CC genotype, P<0.05.

Conclusion: Increased plasma Hcy level was the risk factor for LEDVT formation and the TT polymorphism of MTHFR might be one of the important genetic risk factors.

book=3,ebook=91

Lower extremity deep venous thrombosis formation; Homocysteine; 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase

350001 福建省福州市，福建省立醫(yī)院 心血管內(nèi)科(鄭永紅、陳群）；泉州市一醫(yī)院 心血管內(nèi)科（朱德曉）； 三明市第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科（張世袍）

鄭永紅 副主任醫(yī)師 碩士 主要從事心血管疾病的臨床診斷治療和研究 Email: zhengyongh@21cn.com 通訊作者：鄭永紅

R54

A

1000-3614（2014）03-0209-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.03.013

2013-10-25）

（編輯：王寶茹）