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新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)藥品檢驗所，新疆 喀什 844000

7種維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法學(xué)驗證

楊曉琴司馬義江.阿布都熱西提*

新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)藥品檢驗所，新疆 喀什 844000

目的建立松布力糖漿、強(qiáng)心艾維西木糖漿、木米亞片、復(fù)方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復(fù)方賽比爾片及庫克亞片等維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法。方法根據(jù)《中國藥典》2010年版的規(guī)定，用5種陽性對照菌組對回收率試驗進(jìn)行檢測樣品是否含抑菌成分。結(jié)果松布力糖漿及強(qiáng)心艾維西木糖漿無明顯抑菌現(xiàn)象，可以采用平皿法；木米亞片、復(fù)方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復(fù)方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%，有明顯的抑菌作用，應(yīng)該采用培養(yǎng)基稀釋法?？刂凭炞C中，試驗菌生長很好。結(jié)論該方法對所選7種樣品的檢驗有效可行，可用于上述品種的微生物限度檢查。

微生物限度檢查；方法學(xué)驗證；醫(yī)院制劑

原料的處理不當(dāng)或者包裝不嚴(yán)密等是導(dǎo)致醫(yī)院制劑污染的主要原因，為了達(dá)到藥品生產(chǎn)的安全指標(biāo)必須對其進(jìn)行微生物限度檢查保證制劑的安全有效。

1 試驗材料

1.1 供試品 松布力糖漿(批號：201303084-1、201303084-2、201303084-3)；強(qiáng)心艾維西木糖漿(批號：201303083-1、201303083-2、201303083-3)；木米亞片(批號：201304102-1、201304102-2、201304102-3)；復(fù)方蘇潤江片(批號：201303078-1、201303078-2、201303078-3)；通竅阿亞然及派克片(批號： 201303075-1、201303075-2、201303075-3)；復(fù)方賽比爾片(批號：201303073-1、201303073-2、201303073-3)庫克亞片(批號：201303057-1、201303057-2、201303057-3)，以上制劑均由喀什地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供。

1.2 試驗用菌種(第四代) 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 稀釋液、緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：100708)。

1.4 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：0102262)、膽鹽乳糖增菌液(批號：0102282)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：101213)、虎紅培養(yǎng)基(批號：010214)、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基(批號：100128)、膽鹽硫乳發(fā)酵培養(yǎng)基，均由北京三藥科技開發(fā)有限公司提供。

1.5 其他物品按規(guī)定滅菌備用。

2 方法和結(jié)果

2.1 菌液的制備 取大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]的新鮮培養(yǎng)物，分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24h；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種于改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液(使用前高壓霉菌使成無菌)稀釋成1ml含50～100cfu菌的菌懸液；黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種于改良馬丁瓊脂斜面的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5至7天，使大量孢子產(chǎn)生，用0.9%無菌氯化鈉溶液，將其洗脫，然后用0.9%的無菌氯化鈉溶液把菌液稀釋至1ml中含50～100cfu的菌懸液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌液的檢驗 分別取上述三種菌菌懸液各1ml，注入用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml的平皿中，平行測定兩皿，30℃至35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)，菌液應(yīng)為每ml含50～100cfu。

取上述白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液各1ml，用加入有虎紅瓊脂培養(yǎng)基20ml的平皿中，為了減少實驗中的隨機(jī)誤差平行測定兩皿，規(guī)定的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)72小時，觀察，計數(shù)，菌液中有效菌株的濃度應(yīng)該在每1ml含50～100cfu的范圍之內(nèi)。

2.3 供試品溶液的制備[2]分別取已準(zhǔn)備好的固體樣品各10g，研細(xì)，液體樣品10ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，制成10-1的供試液。

3 回收率測定[1]

3.1 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計數(shù)方法的驗證

3.1.1 平皿法：取供試液1ml及50～100cfu的試驗菌，分別加入培養(yǎng)皿中，平行制備2個平皿，將它凝固后，培養(yǎng)48小時，按《中國藥典》規(guī)定的方法測定其菌落數(shù)，結(jié)果見表1。

由表1可知，松布力糖漿及強(qiáng)心艾維西木糖漿對上述五種代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現(xiàn)象，細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用平皿法，其他的制劑對可能含有抑菌成分需要進(jìn)一步驗證。

表1 平皿法接種陽性對照組回收率試驗結(jié)果(%)

3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法 將上述試驗菌株接種于0.2ml/皿、0.1ml/皿的供試品液中，再加20ml瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時，觀察結(jié)果，細(xì)菌計數(shù)，測定其回收率，結(jié)果見表2、3。

表2 培養(yǎng)基稀釋法(0.2mL/皿)接種陽性菌回收率試驗結(jié)果(%)

從表2可以看出木米亞片、復(fù)方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片庫克亞片等品種對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現(xiàn)象。細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml/皿)。

表3 培養(yǎng)基稀釋法(0.1ml/皿)接種陽性菌回收率試驗結(jié)果(%)

從表3可以看出復(fù)方賽比爾片對上述代表菌回收率均高于70%以上，無明顯抑菌現(xiàn)象。細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查可以采用培養(yǎng)基稀釋法(0.1ml/皿)。

3.2 控制菌檢查方法驗證

3.2.1 陰性菌對照組 取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18-24h，陰性菌對照組為陰性(未生長)；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種亞酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18～24h，陰性菌對照組為陰性(未生長)；取金黃色葡萄球菌50～100cfu/ml，接種膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)18～24h，陰性菌對照組為陰性(未生長)。

3.2.2 試驗組 取3瓶(100 ml/瓶)膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，分別接入1: 10供試液10ml，取3支膽鹽乳糖發(fā)酵管，分別接入1:10供試液1ml；取3瓶 (200ml/瓶)亞硝酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基，分別接入樣品10g；每組其中一瓶(管)作為樣品組；另一瓶(管)加入相應(yīng)的陰性對照菌作為試驗組；第三瓶(管)加入相應(yīng)的陽性對照菌作為陰性菌對照組；置35℃培養(yǎng)24～48h，結(jié)果見表4。

表4 控制菌驗證結(jié)果

注：正常生長用“+”正表示，未生長用“·”表示，未進(jìn)行試驗用“0”表示。

4 討論

從表1中可見第一及第二個制劑中的回收率不低于70%，對細(xì)菌的生長基本無抑制作用，可以采用平皿法。木米亞片、復(fù)方蘇潤江片、通竅阿亞然及派克片、復(fù)方賽比爾片及庫克亞片等對金黃色黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸埃希菌的回收率均值在65%-88%之間，說明有顯著地抑菌作用，所以應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法。根據(jù)實驗結(jié)果確定下屬試驗方法。

表5 7種維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法的匯總

本試驗結(jié)果表明：松布力糖漿及強(qiáng)心艾維西木糖漿對5種陽性對照菌的平皿法的回收率達(dá)到70%以上，證明無明顯的抑菌作用，因此常規(guī)方法可以做上述兩種制劑的微生物限度檢查。抑菌作用比較弱的木米亞片，復(fù)方蘇潤江片，通竅阿亞然及派克片，復(fù)方賽比爾片及庫克亞片可以采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml/皿)。

[1] 馬越，特玉香，杜平華，等．16種中成藥微生物限度檢査法的驗證[J]．中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6(6)：356-359．

[2] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-88．

楊小琴 主管藥師。

司馬義江.阿布都熱西提，主管藥師，E-mail：simayi1102@126.com。

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1007-8517(2014)06-0003-02

2014.01.16)