邱 剛，房保栓，魏 強(qiáng)，苑曉燁，吳大勇，辛國宏

1)河北省人民醫(yī)院腫瘤二科 石家莊 050051 2)河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 石家莊 050051 3)河北省人民醫(yī)院老年病二科 石家莊 050051 4)河北省人民醫(yī)院腫瘤三科 石家莊 050051

miR-126對Hela細(xì)胞增殖的影響及其與CRKL的靶向關(guān)系

邱 剛1)，房保栓1)，魏 強(qiáng)2)，苑曉燁3)，吳大勇2)，辛國宏4)#

1)河北省人民醫(yī)院腫瘤二科 石家莊 050051 2)河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 石家莊 050051 3)河北省人民醫(yī)院老年病二科 石家莊 050051 4)河北省人民醫(yī)院腫瘤三科 石家莊 050051

#通訊作者，男，1975年9月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的發(fā)病機(jī)制及臨床診療，E-mail：xinguohong@126.com

宮頸癌；miR-126；CRKL；增殖

目的：探討miR-126對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖活性的影響及其與CRKL的靶向關(guān)系。方法構(gòu)建miR-126、CRKL野生型(CRKL-WT)和突變型(CRKL-MT)真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT。采用實時熒光定量PCR法檢測未轉(zhuǎn)染、pcDNATM6.2-GW轉(zhuǎn)染和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞miR-126和CRKL mRNA的表達(dá)水平，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性，Western blot法檢測細(xì)胞CRKL蛋白的表達(dá)水平。將細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-MT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-MT，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測細(xì)胞熒光素酶活性。結(jié)果與pcDNATM6.2-GW轉(zhuǎn)染組細(xì)胞比較，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組細(xì)胞miR-126 mRNA過表達(dá)(t=545.891,P<0.05)，CRKL mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(t=135.755、180.661,P<0.05)，同時細(xì)胞的增殖活性亦降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT的Hela細(xì)胞熒光素酶活性下調(diào)(Fpre-miR-126=55.627，F(xiàn)CRKL=61.843，F(xiàn)交互=76.203，P均<0.001)。結(jié)論miR-126的過表達(dá)能夠顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖，并且與CRKL具有良好的靶向關(guān)系。

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳癌[1]。宮頸癌早期可考慮手術(shù)治療，晚期多以放療為主，病死率較高，預(yù)后較差。目前對于宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制仍不甚清楚。miRNAs作為一類重要的小分子非編碼RNA，主要通過作用于其下游靶基因mRNA的3’UTR區(qū)，抑制或降解靶基因mRNA的表達(dá)，從而參與多種基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前研究[2]已經(jīng)證實miRNAs的異常表達(dá)對于多數(shù)人類腫瘤的發(fā)生具有重要的調(diào)控作用。miR-126作為抑癌基因，其異常表達(dá)能夠引起多種人類惡性腫瘤的發(fā)生，與癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖關(guān)系密切[3-7]，但有關(guān)miR-126在宮頸癌中的相關(guān)研究甚少。作者采用生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)miR-126與CRKL(V-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like)存在良好的堿基互補(bǔ)關(guān)系，推測二者之間可能存在靶向關(guān)系。作者通過構(gòu)建miR-126、CRKL野生型和突變型真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人類宮頸癌Hela細(xì)胞株，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、MTT法、雙熒光素酶報告基因檢測及Western blot等方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力的變化，驗證miR-126與CRKL的關(guān)系，探討miR-126對Hela細(xì)胞CRKL的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料Hela細(xì)胞株、pmirGLO和pcDNATM6.2-GW真核表達(dá)載體、大腸桿菌DH5α均由該研究室保存。Hela細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ和XhoⅠ，T4 DNA連接酶，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT)和SYBR(Premix Ex TaqTMⅡ)均購自TaKaRa公司。質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒購自天根生化(北京)科技公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol購自Invitrogen公司。MTT、DMSO購自Sigma 公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司。10×Annealing Buffer、蛋白裂解液RIPA和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。PVDF膜和蛋白發(fā)光液購自Millipore公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司。小鼠抗人CRKL抗體(#3182)購自Cell Signaling公司，小鼠抗人β-actin抗體購自Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2miR-126、CRKL野生型和突變型基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建從miRBase數(shù)據(jù)庫(http：//www.mirbase.org/)中檢索到hsa-miR-126的前體頸環(huán)序列pre-miR-126(5’-CGCUGGCGACGGGACAUUAU UACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGU ACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA-3’)，在該序列及其互補(bǔ)序列兩端加入Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位點。在mirecords網(wǎng)站(http：//mirecords.biolead.org)根據(jù)堿基互補(bǔ)原則篩選成熟miR-126的候選靶基因CRKL序列(5’-GUAACUGCUGUCG GUGUGG-3’)，并在該序列及其互補(bǔ)序列兩端加入SacⅠ和XhoⅠ酶切位點。同時在miR-126與CRKL互補(bǔ)的種子區(qū)域設(shè)計突變位點(圖1)。所有序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的單鏈序列經(jīng)10×Annealing Buffer 95 ℃退火4 min至雙鏈。對pcDNATM6.2-GW進(jìn)行Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切，對pmirGLO進(jìn)行SacⅠ和XhoⅠ雙酶切；采用T4 DNA 連接酶將pre-miR-126與pcDNATM6.2-GW酶切后的大片段重組，將CRKL野生型(CRKL-WT)和CRKL突變型(CRKL-MT)雙鏈DNA分別與pmirGLO酶切后的大片段重組，16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含抗生素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取陽性克隆置于LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖菌過夜，12 h后提取質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定，并進(jìn)行NCBI BLAST系統(tǒng)比對分析。重組載體分別為pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT。

圖1 miR-126與CRKL靶向預(yù)測互補(bǔ)關(guān)系及突變型設(shè)計圖

1.3miR-126對Hela細(xì)胞CRKL表達(dá)影響的觀察

1.3.1 細(xì)胞分組 將Hela細(xì)胞接種于6孔板中，每孔(2～6)×105個細(xì)胞，分3組培養(yǎng)，每組3個復(fù)孔。空白對照組：細(xì)胞不作處理，常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組：按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體。

1.3.2 細(xì)胞中miR-126和CRKL mRNA的檢測 采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-126 mRNA 表達(dá)水平，用以評價重組載體的轉(zhuǎn)染效率。miR-126逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATTA-3’；PCR引物序列上游為5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游為5’-TGCTTCGTACCGTGAGTAA-3’，以U6作為內(nèi)參。同法檢測細(xì)胞中CRKL mRNA 表達(dá)水平，CRKL PCR引物序列上游為5’-GTCTTT GCGAAAGCAATC-3’，下游為5’-GTATCTCGCCATG GCCTCAAG-3’，以β-actin作為內(nèi)參。采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR，采用2-ΔΔCt計算miR-126和CRKL mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞中CRKL 蛋白的檢測 按照RIPA裂解液說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，分光光度法測定蛋白濃度，配置100 g/L SDS-PAGE凝膠，凝膠上樣量約為20 μg，80 V 30 min、100 V 1 h電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入小鼠抗人CRKL抗體(#3182)4 ℃孵育過夜，抗體稀釋1 000倍，TBST洗膜，加二抗常溫孵育1.5 h，TBST洗膜，蛋白發(fā)光液顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，采用Image J分析條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4miR-126對Hela細(xì)胞增殖影響的觀察將Hela細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約4×103個，分為3組，每組3個復(fù)孔，分別為空白對照組、pcDNATM6.2-GW組和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組，按1.3.1方法轉(zhuǎn)染相應(yīng)抗體，每4～6 h更換1次培養(yǎng)基，分別于37 ℃孵育24、48和72 h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。

1.5miR-126對CRKL的靶向作用觀察取對數(shù)期Hela細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約4×103個，分為4組，每組3個復(fù)孔，分別共轉(zhuǎn)染pcDNATM 6.2-GW和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-MT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-MT。轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告系統(tǒng)說明書操作，上機(jī)檢測并計算熒光素酶活性。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，pcDNATM6.2-GW組和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組細(xì)胞miR-126、CRKL mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，空白對照組、pcDNATM6.2-GW組和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組細(xì)胞增殖活性的比較采用單因素方差分析，采用2×2析因設(shè)計的方差分析對miR-126和CRKL基因表達(dá)對Hela細(xì)胞熒光素酶活性的影響進(jìn)行評價，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miR-126與CRKL真核表達(dá)載體的鑒定重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST系統(tǒng)比對，結(jié)果如圖2所示，提示無堿基突變和丟失，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT重組載體均構(gòu)建成功。

圖2 miR-126與CRKL真核表達(dá)載體的測序結(jié)果

A：pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126；B：pmirGLO-CRKL-WT；C：pmirGLO-CRKL-MT。

2.2pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126轉(zhuǎn)染對Hela細(xì)胞miR-126mRNA、CRKLmRNA和蛋白表達(dá)的影響與pcDNATM6.2-GW組比較，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組細(xì)胞miR-126表達(dá)水平升高，同時CRKL mRNA和蛋白表達(dá)水平降低(表1)，提示pre-miR-126在Hela細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)染效率，并且可顯著抑制CRKL的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。

表1 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126轉(zhuǎn)染對Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及對CRKL mRNA和蛋白表達(dá)的影響

2.3pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126轉(zhuǎn)染對Hela細(xì)胞增殖活性的影響pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126組細(xì)胞增殖活性顯著低于pcDNATM6.2-GW組和空白對照組(表2)。

表2 3組細(xì)胞增殖活性測定結(jié)果

*:與空白對照組比較，P<0.05；#：與pcDNATM6.2-GW組比較，P<0.05。

2.4miR-126對Hela細(xì)胞CRKL的靶向作用pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126與pmirGLO-CRKL-WT共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(表3)。

表3 4組熒光素酶活性的比較

Fpre-miR-126=55.627，F(xiàn)CRKL=61.843，F(xiàn)交互=76.203，P均<0.001。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展受到多種因素的影響，其中腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)在其中發(fā)揮了重要的作用。miRNAs在宮頸癌的發(fā)生過程中可大致分為抑癌作用和致癌作用兩大類。miR-99在宮頸癌中呈低表達(dá)，可以通過靶向調(diào)控TRIB2來抑制Hela細(xì)胞的增殖能力[8]；miR-203不僅能夠通過下調(diào)VEGFA抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，還可以抑制血管的生成[9]；而miR-224在宮頸癌中的表達(dá)顯著增高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲度等不良預(yù)后指征呈正相關(guān)[10]。miR-126的異常表達(dá)能夠引起多種人類惡性腫瘤的發(fā)生。體外實驗[4]發(fā)現(xiàn)miR-126可以通過靶向作用于CXCR4抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-126的表達(dá)下調(diào)與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在HCT116、SW620和HT-29多種結(jié)腸癌細(xì)胞中均觀察到miR-126呈低表達(dá)，并且miR-126可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路來調(diào)控上述細(xì)胞的增殖[5]。此外，miR-126不僅能夠在惡性黑色素瘤中直接靶向作用于ADAM9和MMP7，抑制細(xì)胞的侵襲，還可以通過抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞的募集抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6-7]。CRKL屬于銜接蛋白CRK家族成員之一，在多種腫瘤中表達(dá)，可能誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。Cheung等[11]認(rèn)為CRKL的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并能夠?qū)Ρ砥どL因子抑制劑產(chǎn)生抗性，加重病情的進(jìn)展。CRKL可能通過上調(diào)Cyclin D1和Cyclin B1蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)CRKL高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。該研究中，作者在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，篩選出miR-126的候選靶基因CRKL，并成功構(gòu)建了pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT真核表達(dá)載體；與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126的Hela細(xì)胞miR-126過表達(dá)，CRKL mRNA和蛋白表達(dá)水平亦明顯降低，同時細(xì)胞的增殖活性顯著降低；雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT的Hela細(xì)胞熒光素酶活性降低。上述實驗結(jié)果提示，miR-126能夠顯著抑制Hela細(xì)胞CRKL的表達(dá)，二者之間存在良好的靶向關(guān)系。miR-126可能通過靶向調(diào)控CRKL參與宮頸癌細(xì)胞增殖活性的調(diào)控。

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(2013-12-03收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of miR-126 on proliferation of human cervical carcinoma Hela cells and target relationship with CRKL

QIUGang1)，F(xiàn)ANGBaoshuan1)，WEIQiang2)，YUANXiaoye3)，WUDayong2)，XINGuohong4)

1)SecondaryDepartmentofOncology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 2)DepatmentofNuclearMedicine，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 3)SecondaryDepartmentofGeriatrics，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 4)ThirdDepartmentofOncology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051

cervical carcinoma；miR-126；CRKL；proliferation

Aim：To assess the effect of miR-126 on proliferation of human cervical carcinoma Hela cells and target relationship between miR-126 and CRKL.Methods：Recombinant plasmids of pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 targeted at miR-126，pmirGLO-CRKL-WT targeted at wide type CRKL gene and pmirGLO-CRKL-MT targeted at mutant type CRKL gene were constructed.qRT-PCR method was used to detect miR-126 and CRKL mRNA in cells transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 or empty vector，and cells without transfection.Western blot method was used to detect CRKL protein.MTT method was used to detect the proliferation.The cells were divided into 4 group，and co-transfected with pcDNATM6.2-GW and pmirGLO-CRKL-WT，pcDNATM6.2-GW and pmirGLO-CRKL-MT，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-WT，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-MT，respectively，dual-luciferase assay system was used to detect the luciferase activity in cells.Results：Compared with those of cells transfected with empty vector，the expression of miR-126 mRNA in the cells transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 increased(t=545.891,P<0.05)，while CRKL mRNA and protein expression decreased(t=135.755,180.661,P<0.05)，and the proliferation activity decreased(P<0.05).Luciferase activities of the cells co-transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-WT decreased as well(FmiR-126=55.627，F(xiàn)CRKL=61.843，F(xiàn)interaction=76.203，P<0.001).Conclusion：Overexpression of miR-126 could suppress cell proliferation by targeting CRKL in Hela cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.05.034

R737.33