汪招雄,康銀峰，孫敏華，高詩敏，謝鵬，任濤

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)(農(nóng)業(yè)部獸用疫苗重點創(chuàng)造實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642)

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一種以呼吸道、消化道粘膜出血為典型病變的高度接觸性、急性敗血性禽類傳染病，是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類傳染病[1]。

NDV屬于副粘病毒科副粘病毒亞科腮腺炎病毒屬有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組主要編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,L)、磷蛋白(phosphate protein,P)、血凝素神經(jīng)氨酸酶(haem-agglutinin neuraminidase protein,HN)、細(xì)胞融合蛋白(fusion protein,F)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,NP)和膜蛋白(matrix,M)等6種結(jié)構(gòu)蛋白以及P基因編輯產(chǎn)生的2種非結(jié)構(gòu)蛋白如V、W蛋白。NDV通過在其P基因第484位保守的編輯位點上插入一個鳥嘌呤核苷酸G致使閱讀框后移一位產(chǎn)生V基因,插入2個G則產(chǎn)生W基因，V、W蛋白與P蛋白具有共同的獨特的N末端區(qū)域和各自高度保守的C末端區(qū)域[2]。近年來的研究表明，NDV V蛋白具有增強病毒復(fù)制的作用，不同的NDV V蛋白因為其C-端氨基酸存在差異，導(dǎo)致了病毒復(fù)制的差異，毒力強的病毒V蛋白能明顯增強病毒的復(fù)制[3]。而目前對NDV W蛋白功能的研究較少。本研究旨在探討不同毒力的NDV V和W蛋白對細(xì)胞凋亡的影響，為這2種蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與試劑

pEGFP-N1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病實驗室保存，pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W由筆者自行構(gòu)建，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病實驗室保存。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明將pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。設(shè)置不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照組。

1.3 熒光顯微鏡下觀察 NDV V和W基因在DF-1細(xì)胞中真核表達產(chǎn)物

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1 24h后，將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下，觀察GFP在細(xì)胞中的表達情況并拍照。

1.4 流式檢測細(xì)胞凋亡

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、36h和48h，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞。先后應(yīng)用7-AAD和Annexin V-PE作用細(xì)胞，在反應(yīng)1h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞凋亡情況。使用未經(jīng)處理的正常細(xì)胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV V和W基因真核表達產(chǎn)物在DF-1細(xì)胞中的表達情況

利用熒光倒置顯微鏡對各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進行觀察，在轉(zhuǎn)染后12h，可見pEGFP-La V 、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，證明在轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞克隆中有融合蛋白的表達。隨著時間的推移，各組細(xì)胞熒光強度均有增強，圖1為轉(zhuǎn)染24h后各組細(xì)胞綠色熒光圖片。

圖1 轉(zhuǎn)染24h后融合蛋白La V-GFP、La W-GFP、GM V-GFP和GM W-GFP在DF-1細(xì)胞中的表達

2.2 流式檢測細(xì)胞凋亡情況

pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和空載體pEGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到DF-1 24、36h和48h后，收集各組細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測。早期凋亡以Annexin V-PE染色為主，在流式細(xì)胞分析圖(圖2)中為右下區(qū)(F4)細(xì)胞簇，晚期凋亡為Annexin V-PE/7-AAD雙染色，在流式細(xì)胞分析圖中為右上區(qū)(F2)細(xì)胞簇。

檢測結(jié)果表明，相對于空白細(xì)胞對照組，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、36h和48h，所有轉(zhuǎn)染組誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有明顯的提高，并且隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，細(xì)胞早期凋亡率逐漸上升。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞的凋亡率在14.26%～17.09%之間，差異不大，但是都明顯高于空載體組。而在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36h，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為45.05%和43.4%，明顯高于pEGFP-La V和pEGFP-La W誘導(dǎo)的31.44%和38.64%的凋亡率。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率均超過50%，pEGFP-GM W真核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率達到了43.4%，而pEGFP-La V真核表達產(chǎn)物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率最低，為33.44%。結(jié)果表明，來源于不同毒力NDV毒株非結(jié)構(gòu)蛋白 V和W均能誘導(dǎo)細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡，但是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力存在一定的差異(圖2和表1)。

圖2 NDV V和W基因真核表達產(chǎn)物對DF-1細(xì)胞凋亡影響(轉(zhuǎn)染48 h)

組別及轉(zhuǎn)染時間凋亡比例/%F1F2F3F4組別及轉(zhuǎn)染時間凋亡比例/%F1F2F3F4Blank-24h0.050.0299.170.76N1-24h1.780.0087.8010.42Blank-36h0.000.0096.713.29N1-36h6.850.0074.6218.53Blank-48h0.070.0097.332.60N1-48h14.000.0153.2432.75GM V-24h0.090.0085.6514.26La V-24h0.140.0184.2915.56GM V-36h0.060.0254.8745.05La V-36h0.120.1068.3431.44GM V-48h0.280.0152.9746.74La V-48h0.000.0066.5633.44GM W-24h0.160.0382.7217.09La W-24h0.260.0083.6416.10GM W-36h0.060.0256.5243.40La W-36h0.060.0361.2738.64GM W-48h0.210.0849.2050.51La W-48h0.290.0049.6550.06

注：1.Blank：正常細(xì)胞對照組；La V：pEGFP-La V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；La W：pEGFP-La W質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；GM V：pEGFP-GM V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；GM W：pEGFP-GM W質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；N1：空載體pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。2． F1：機械損傷細(xì)胞；F2：晚期細(xì)胞凋亡；F3：正常細(xì)胞；F4：早期凋亡細(xì)胞組。

3 討論

機體正常的細(xì)胞凋亡對機體的正常發(fā)育和新陳代謝是必要的，有助于維持組織穩(wěn)態(tài)，是宿主抵抗多種有害因素的一種有效防御機制。而病毒感染宿主細(xì)胞后，它需要利用宿主的物質(zhì)和能量系統(tǒng)來完成病毒的復(fù)制過程。病毒感染后引起細(xì)胞凋亡,不利于病毒增殖而有利于病毒擴散;病毒進入細(xì)胞后表達的一些病毒蛋白將會引起細(xì)胞的凋亡過程。

近年來，很多學(xué)者對NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進行了廣泛的研究。房慧伶等[4]和李翔等[5]應(yīng)用NDV標(biāo)準(zhǔn)強毒F48E8株感染雞，發(fā)現(xiàn)該毒株可以在體內(nèi)誘導(dǎo)胸腺和法氏囊淋巴細(xì)胞凋亡,并認(rèn)為由此所致的免疫抑制可能是NDV致病的重要原因。蔣麗娜等[6]用NDV感染體外培養(yǎng)S180肉瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，該病毒對S180細(xì)胞增殖有明顯抑制作用,可誘導(dǎo)S180細(xì)胞凋亡。崔玉東等[7]應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)新NDVⅠ系毒株能通過Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)凋亡,其中Caspase28和Caspase29在凋亡中發(fā)揮重要作用,而Caspase23和Caspase210在凋亡中不發(fā)揮作用。Ravindra等[8-11]也研究發(fā)現(xiàn)，NDV 感染能夠通過Caspase依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞，在感染NDV的Vero細(xì)胞中，感染24h的Caspase 8 活性高于感染48h的活性，而Caspase 9活性表現(xiàn)在這2個時間點正好相反，Caspase 3在這2個時間點活性都比較高?；诖耍P者認(rèn)為NDV感染48h 后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要是通過外源性凋亡途徑。而且，病毒感染后增加Bax轉(zhuǎn)化Bcl-2率，p53和Caspase 3、8、9表達。將NDV HN蛋白作用CEF顯示，該蛋白能夠通過提高Caspase 1、9、8、3活性，減損線粒體膜潛能和增加細(xì)胞氧化應(yīng)激能力來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

然而，還沒有發(fā)現(xiàn)NDVV和W蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報道。在本研究中，將pEGFP-La V、 pEGFP-La W、pEGFP-GM V、pEGFP-GM W和pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞中后，在不同時間點分別檢測了各組DF-1細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn),NDV V和W基因的真核表達產(chǎn)物均能誘導(dǎo)很高比例的DF-1發(fā)生細(xì)胞凋亡。但是V和W蛋白是通過什么途徑對DF-1細(xì)胞細(xì)胞造成凋亡的，尚需進一步研究。

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