葉 芳，劉曉靜，張進霞

(甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

氮素是植物體內蛋白質、核酸、葉綠素和一些激素等的重要組成部分，是構成作物生長和產(chǎn)量形成的首要因素[1-3]。氮肥對豆科植物根瘤菌侵染、根瘤發(fā)育、固氮等都有影響。氮素供應不足時會抑制根瘤的生長發(fā)育[4]，從而進一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮。苜蓿作為家畜飼用的重要豆科牧草，可以借助根瘤中的共生固氮菌直接吸收空氣中的分子態(tài)氮，但其固氮量遠遠不能滿足苜蓿生長發(fā)育對氮的需求，還必須施用氮肥。適量施氮不僅可以促進苜蓿根的分枝，增加根長，提高根重，還能明顯促進紫花苜蓿結瘤固氮、增加紫花苜蓿的鮮干草產(chǎn)量及營養(yǎng)品質[5-7]。因此，適量的施氮肥不僅對苜蓿有一定的增產(chǎn)效果[8，9]，而且對我國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

NO3--N和NH4+-N是植物生長過程中主要的兩種礦質氮源，對植物的生長和發(fā)育有著重要作用[10]。研究表明，NO3--N可以促進植物根系的長度生長以及表面積和密度的增加[11]，NH4+-N可以促進紫花苜蓿生物量積累和結瘤固氮[12]。與單一的NO3--N或NH4+-N比，將NO3--N和NH4+-N以適度比例混合施用可以促進絕大多數(shù)旱作作物生長。Duxbury等[13]報道，苜蓿枝條的高度、單株重量和枝條數(shù)均隨NH4NO3施用量的增加而增加。Feil B等[14]研究表明，單一的施用NO3--N或NH4+-N均會引起水稻生物量積累的減少，同時供應兩種形態(tài)氮素比供應單一形態(tài)氮素更能顯著提高水稻的氮素利用率，促進植物生長。目前，有關氮素對紫花苜蓿影響的研究由來已久，而其對苜蓿生長和生理特性也均有影響，但為了進一步研究氮素形態(tài)對“甘農3號”紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，試驗采用砂培法，通過營養(yǎng)液控制氮素形態(tài)來對比研究不同外源氮素對“甘農3號”紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，以期為紫花苜蓿合理的氮素供應提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試紫花苜蓿品種為“甘農3號”紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 選取大小均勻，顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，95%乙醇浸泡5 min后，0.1% HgCl2溶液滅菌3 min，無菌水沖洗5～6次，最后用無菌濾紙吸干，備用[15]。

1.2.2 營養(yǎng)液配置 Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1000 mL，pH6.5～7.0。Gibson微量元素液H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[16]。

1.3 試驗設計

選用直徑16 cm、高20 cm的花盆，裝入經(jīng)自來水沖洗再用蒸餾水清洗并經(jīng)過高溫滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒滅菌種子，播種14 d后進行間苗，每盆保苗50株，然后澆入營養(yǎng)液，置于塑料防雨棚。設3種氮素形態(tài)：NO3--N，NH4+-N和混合態(tài)氮(NO3--N和NH4+-N按1∶1混合)；根據(jù)前期試驗結果[17]設3個氮素水平0、105、210 mg/L(以純氮計，最高濃度為霍格蘭營養(yǎng)液中氮素的濃度，低氮為其倍數(shù))，共7個處理，分別以0、NO3--105、NO3--210、NH4+-105、NH4+-210、NO3-+ NH4+-105、NO3-+NH4+-210表示，每處理重復15次，共105個處理，完全隨機排列。以Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液為基本營養(yǎng)液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調節(jié)pH為7，結合無氮營養(yǎng)液一同施入。

2013年4月25日播種，每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對生真葉完全展開；之后每周淋澆1次配制營養(yǎng)液，每次500 mL；每7 d用蒸餾水淋洗盆栽1次以防止砂培中鹽分積累，而后澆入新配制營養(yǎng)液。紫花苜蓿生長至三片復葉時，每盆接種新培養(yǎng)的苜蓿根瘤菌液50 mL(中華根瘤菌Sinorhizobiummeliloti)。在盛花期測定紫花苜蓿株高，生物量，莖葉比，根瘤數(shù)，根瘤重，固氮酶活性和全氮含量。

1.4 測定方法

株高 用直尺直接測量，每個處理重復30次。

生物量 用濾紙吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下殺青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，稱其干重。每個處理重復6次。

莖葉比 以每個處理各取6株長勢相當?shù)膯吻o，進行莖葉分離，分別置入烘箱105 ℃下殺青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，稱其干重。莖和葉的干重之比即為莖葉比。

統(tǒng)計單株根瘤數(shù)，每處理取10株。

根瘤重 將每個單株上摘下的根瘤在電子天平上稱其鮮重，每個處理重復10次。

固氮酶活性 采用乙炔還原法測定[18，19]。稱取0.2 g的新鮮根瘤置于7 mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出0.7 mL空氣，注入0.7 mL乙炔，室溫下反應30 min，待機器穩(wěn)定后，用微量注射器抽取混合氣體25 μL注入氣相色譜儀(GC)進樣柱中，測定C2H2、C2H4峰值。然后在同樣條件下用標準乙烯測定并繪制乙烯的標準曲線，由此計算根瘤樣品的固氮酶活性。每個處理3次重復。測定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫180 ℃，進樣器150 ℃，F(xiàn)ID檢測器170 ℃。氣體壓力N2為0.3 mPa，H2為0.08 mPa，空氣為0.15 mPa。C2H4水平[(μmol/(g·h)] =h·x(樣品峰面積)×C(標準C2H4水平，μmol/mL)/ hs(標準C2H4峰面積)×24.9×t(C2H2反應時間，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含 量采用濃H2SO4-H2O2法測定[20]，每個處理重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)整理，并用SPSS 17.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 氮素形態(tài)對紫花苜蓿盛花期株高、地上生物量、地下生物量和莖葉比的影響

氮素形態(tài)對紫花苜蓿盛花期的株高、地上生物量和地下生物量均有顯著的影響。在接種根瘤菌并且其他營養(yǎng)供應充分的條件下(表1)，不同氮素形態(tài)處理下紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均顯著高于CK(P<0.05)，且隨著氮素水平的增加呈現(xiàn)增大的變化趨勢。但NH4+-N處理下紫花苜蓿的地上生物量卻隨著氮素水平的增加而減小。同一氮素水平下，紫花苜蓿的株高表現(xiàn)為：NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NO3--N培養(yǎng)下次之，NH4+-N培養(yǎng)下的最低，各氮素形態(tài)處理間差異顯著(P<0.05)。

地上和地下生物量總體表現(xiàn)為NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N培養(yǎng)下的最低，各氮素形態(tài)處理間有顯著差異(P<0.05)，氮素濃度為105 mg/L時，紫花苜蓿的地下生物量表現(xiàn)為NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N。當NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均取得最大值。

隨著氮素水平的增加，紫花苜蓿的莖葉比呈現(xiàn)減小的變化趨勢，在相同的氮素水平下，不同形態(tài)氮素處理下紫花苜蓿的莖葉比表現(xiàn)為NO3--N培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下的最低，且差異顯著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿的莖葉比最小，為0.750，此時苜蓿的營養(yǎng)成分最高。

表1 不同氮素形態(tài)下紫花苜蓿株高、地上生物量、地下生物量和莖葉比Table 1 Nitrogen forms of the plant height,aboveground biomass,underground biomass and stem/leaf ratio of alfalfa

注：同列不同小寫字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同氮素形態(tài)下紫花苜蓿盛花期根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性

不同氮素形態(tài)處理下紫花苜蓿盛花期的根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性均顯著高于CK(P<0.05)，除混合態(tài)氮培養(yǎng)下的根瘤重外，紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性均隨著氮素水平的增加呈現(xiàn)增大的變化趨勢(表2)。在相同的氮素水平下，不同氮素形態(tài)處理下紫花苜蓿的根瘤數(shù)和固氮酶活性均表現(xiàn)為：NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N培養(yǎng)下的最低，各氮素形態(tài)處理間差異顯著(P<0.05)。氮素濃度不同，對紫花苜蓿根瘤重的影響不同，氮素濃度為105 mg/L時，紫花苜蓿的根瘤重表現(xiàn)為：NO3--N+NH4+-N>NH4+-N>NO3--N；氮素濃度為210 mg/L時，則表現(xiàn)為：NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N，各氮素形態(tài)處理間差異顯著(P<0.05)。紫花苜蓿的根瘤數(shù)和固氮酶活性均在NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，取得最大值，但根瘤重在NO3--N+NH4+-N的濃度為105 mg/L時取得最大值，由此可見，在盛花期氮素濃度過高會抑制根瘤的生長。

表2 不同氮素形態(tài)下紫花苜蓿根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性Table 2 Nitrogen forms of root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 氮素形態(tài)對紫花苜蓿盛花期地上部和地下部全氮含量的影響

各氮素形態(tài)處理下紫花苜蓿地上和地下部全氮含量均顯著高于CK(P<0.05)，且隨著氮素水平的增加均呈現(xiàn)增大的變化趨勢。同一氮素水平下，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量均表現(xiàn)為：NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N培養(yǎng)下的最低，各氮素形態(tài)處理間差異顯著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量最高，地上部全氮含量較NH4+-N、NO3--N分別增加了0.14%，0.66%，地下部全氮含量較NH4+-N、NO3--N分別增加了0.45%，0.81%，說明NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿氮含量的積累，NH4+-N處理下全氮含量高于NO3--N，二者以一定的比例混合使用最能增加紫花苜蓿植株體內全氮含量。

圖1 不同氮素形態(tài)下紫花苜蓿地上部和地下部全氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms on aboveground and underground nitrogen content of alfalfa

3 討論與結論

施氮不僅能提高作物的生物產(chǎn)量[21]和種子產(chǎn)量，同時還能增加紫花苜蓿干物質和氮素積累量[22]，可以明顯改善紫花苜蓿的品質[23]，且苜蓿枝條的高度、單株重量和枝條數(shù)均隨NH4NO3施用量的增加而增加。有研究證明，NH4+-N可以使根系明顯變短、加粗，促進側根的形成，從而增強紫花苜蓿營養(yǎng)吸收，促進紫花苜蓿生物量的積累。但董守坤等[24]在大豆的研究上表明，NH4+-N和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生長。試驗表明，盛花期各處理下紫花苜蓿的株高和生物量均顯著高于CK，且隨著氮素水平的增加呈現(xiàn)增大的變化趨勢，也說明施氮能夠促進紫花苜蓿的生長。不同氮素形態(tài)處理下，紫花苜蓿的株高表現(xiàn)為NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NO3--N培養(yǎng)下次之，NH4+-N培養(yǎng)下最低；生物量為NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N培養(yǎng)下最低。說明與單一NO3--N或NH4+-N相比，混合態(tài)氮最能促進紫花苜蓿的生長。分析原因可能是NO3--N和NH4+-N同時存在于生長的介質中會相互影響彼此的吸收速率及吸收動力，NO3--N可以促進植物對NH4+-N的吸收[25]，與混合態(tài)氮相比，單純供應NH4+-N往往會抑制K+和Ca2+的吸收，并帶來氨害，抑制生長[26]；單用NO3--N，亦有不利之處，在還原過程中消耗能量較多，若在弱光條件下，NO3--N吸收有可能受抑制，造成氮素供應不足。Chen等[27]研究也認為，NO3--N和NH4+-N混合營養(yǎng)下植物生長更具優(yōu)勢。莖葉比是衡量苜蓿品質的重要指標，苜蓿葉蛋白含量非常豐富，莖葉比越小，葉片的比例越高，營養(yǎng)物質含量就越多，適口性就越強，牧草的品質也就越好。張杰等[28]在苜蓿的研究中得出施氮量越多，苜蓿的莖葉比越小。試驗也發(fā)現(xiàn)，隨著氮素水平的增加，紫花苜蓿盛花期的莖葉比呈現(xiàn)減小的趨勢，不同形態(tài)氮素處理下紫花苜蓿的莖葉比表現(xiàn)為：NO3--N培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最低。

氮和豆科植物根瘤固氮酶活性、數(shù)量、形態(tài)結構的關系已有報道[29]。根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指標。試驗發(fā)現(xiàn)，不同氮素形態(tài)處理下紫花苜蓿盛花期的根瘤數(shù)、根瘤重、固氮酶活性和全氮含量均高于CK，表現(xiàn)為NO3--N和NH4+-N混合培養(yǎng)下最大，NH4+-N培養(yǎng)下次之，NO3--N培養(yǎng)下的最低，說明適量的NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿結瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。原因可能是NO3--N和NH4+-N同時存在于生長介質中時，會表現(xiàn)出聯(lián)合效應，促進紫花苜蓿結瘤固氮。

綜上所述，NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿盛花期生長和結瘤固氮，但二者混合使用效果最佳，當NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿生長最好。

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