1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省武威腫瘤醫(yī)院，甘肅 武威 733000

藏藥濕生扁蕾對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖調(diào)控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表達(dá)的影響

王雅莉1*景明1，2*張艷霞1，2陳正君1高娜1趙慧巧1劉娟娟1蘇永春3

1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省武威腫瘤醫(yī)院，甘肅 武威 733000

目的探討藏藥濕生扁蕾對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖調(diào)控因子CyclinD1、CDK4、PCNA和p21kip1·mRNA表達(dá)的影響。方法將SW480細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，24h后分別用不同濃度(0.25、0.50、1.00 mg/ml)的濕生扁蕾干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，提取每組總RNA，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用RT-PCR法檢測(cè)CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果PCNA、CyclinD1及CDK4的mRNA表達(dá)隨濕生扁蕾濃度增加而減少，而p21kip1mRNA的表達(dá)隨濕生扁蕾濃度增加而增加，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論藏藥濕生扁蕾干預(yù)SW480細(xì)胞的增殖與其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA的表達(dá)和促進(jìn)p21kip1的表達(dá)作用有關(guān)。

藏藥濕生扁蕾；結(jié)腸癌SW480細(xì)胞；增殖調(diào)控因子

結(jié)直腸癌(ColoreetalCarcinom，CRC)是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，其發(fā)病率高居惡性腫瘤的第2位。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人均壽命的延長(zhǎng)、生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率也明顯上升，每年新增病例己超過(guò)17萬(wàn)，尤其在天津、上海等大城市更為突出，男性高居第3位，女性僅次于乳腺癌而居第2位[1、2]。且其發(fā)病遞增速度已達(dá)世界均數(shù)的兩倍，我國(guó)已全面進(jìn)入結(jié)直腸癌高發(fā)地區(qū)行列。如何有效的預(yù)防和治療CRC，成為醫(yī)學(xué)界高度關(guān)注的重要課題之一。此病在臨床治療方面，雖然以手術(shù)、藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療、放療等治療手段為患者帶來(lái)了希望。但治療過(guò)程中常用的化療藥普遍存在價(jià)格高、毒副作用大的缺點(diǎn)。因此，尋找、研制高效、低毒的藥物就成為目前CRC治療中迫待解決的問(wèn)題。

藏藥濕生扁蕾(GentianopsispaludosaMa)為藏族民間常用草藥，為1年生草本，分布于青海海北、黃南、玉樹(shù)等地區(qū)。具有消熱、解毒和利濕消黃等功效[3]。近年來(lái)倍受關(guān)注。目前，有關(guān)其化學(xué)成分及臨床應(yīng)用已經(jīng)成為研究重點(diǎn)，且多集中在其有效成分的分離、提取、藥理作用等方面。由于其重要的藥用價(jià)值，開(kāi)發(fā)利用有著廣闊的市場(chǎng)前景。濕生扁蕾現(xiàn)已在甘肅、青海作為重要藏藥進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)[4]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，藏藥濕生扁蕾的提取物可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究觀察了濕生扁蕾對(duì)SW480細(xì)胞增殖調(diào)控因子CyclinD1、CDK4、PCNA及p21kip1表達(dá)的影響，探討藏藥濕生扁蕾干預(yù)SW480細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療和新藥開(kāi)發(fā)開(kāi)拓思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料①藥物：藏藥濕生扁蕾提取物(GTP，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供)，規(guī)格10g原藥材/1g提取物浸膏；②細(xì)胞：結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株)，購(gòu)自齊氏生物科技有限公司；③主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)， PBS(磷酸鹽緩沖液，Hyclone公司)，二甲亞砜(DMSO，Gibco公司)，RT試劑盒(Promega公司)，Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，PCR試劑盒(Promega公司)，Taq聚合酶(TaKaRa公司)，PCR引物(上海英俊生物有限公司)；④主要儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱、5417R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，9600型PCR儀(美國(guó)PE公司)，Gel DOC 2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀和水平式電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)，DU-650型蛋白核酸分析儀(美國(guó)Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 SW480細(xì)胞的培養(yǎng) 采用常規(guī)培養(yǎng)SW480細(xì)胞，培養(yǎng)液為含有10%小牛血清及青、鏈霉素各100u/ml DMEM液，在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至 80%左右融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶/EDTA消化后傳代培養(yǎng)。

1.2.2 SW480細(xì)胞分組 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分成以下4組：空白對(duì)照組(加等體積的PBS)、濕生扁蕾低劑量組(0.25mg/ml)、濕生扁蕾中劑量組(0.5mg/ml)和濕生扁蕾高劑量組(1.0mg/ml)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)CyclinD1、CDK4、PCNA及p21的mRNA的表達(dá)水平 SW480細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞數(shù)約為2×105個(gè)/孔，24h后分別以不同濃度的濕生扁蕾干預(yù)，培養(yǎng)24h后，提取每組總RNA。

1.2.3.1 細(xì)胞總RNA的提取 按照Trizol試劑盒操作說(shuō)明方法進(jìn)行，隨后取2μgRNA按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒要求配制反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物置于-20℃保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3.2 目的基因PCR擴(kuò)增 在NCBI上查目的基因全序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。CyclinD1：F:5′-TGG ATG CTG GAG GTC TGC GAG GAA -3′，R:5′-GGC TTC GAT CTG CTC CTG GCA GGC-3′；CDK4：F:5′-CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGC-3′，R:5′-AAC TGG CGC ATC AGA TCC TAG-3′；PCNA：F:5′-GCT GAC ATG GGA CAC TTA-3′，R:5′-CTC AGG TAC AAA CTT GGT G-3′；p21kip1：F:5′-GCG ACT GTG ATG CGC TAA TGG-3′，R:5′-TAG AAA TCT GTC ATG CTG GTC TGC-3′；GAPDH：F:5′- CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA-3′，R:5′- AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG-3′。取cDNA 1.0?l，加10×Taq Buffer 2.0?l，25 mM Mg2+1.2μl，10 mM dNTP0.4μl，上下游引物各0.4?l，1U/mlTaq酶0.6μl，DEPC水14.0μl配成20μl的總反應(yīng)體積。在95℃預(yù)變性3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物 4℃保存，用于瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物表達(dá) 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl，加2μl的loading buffer(6×)充分混勻后，加到1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，通電，電泳至溴酚藍(lán)染料到達(dá)凝膠最前沿時(shí)停止電泳。

2 結(jié)果

SW480細(xì)胞經(jīng)不同濃度濕生扁蕾提取物作用24 h后，CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達(dá)隨藥物濃度增加而減少，而p21kip1m RNA表達(dá)隨藥物濃度增加而增多，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。見(jiàn)圖1。

圖1 濕生扁蕾對(duì)SW480細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、PCNA和p21kip1的mRNA表達(dá)的電泳圖(內(nèi)參GAPDH)

3 討論

適度的細(xì)胞增殖和凋亡是維持細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)定的重要條件，其調(diào)控錯(cuò)綜復(fù)雜，受到細(xì)胞內(nèi)、外多種因素和環(huán)節(jié)的影響，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，都可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。腫瘤的發(fā)生主要特點(diǎn)是細(xì)胞凋亡不足，增殖過(guò)度，細(xì)胞群體穩(wěn)態(tài)被破壞，導(dǎo)致病變細(xì)胞異常增多，病變組織器官體積增大，功能異常[5]。

CDK是細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的驅(qū)動(dòng)力量之一，其激活依賴于與Cyclin的結(jié)合和其中某些氨基酸殘基的磷酸化狀態(tài)。當(dāng)Cyclin濃度升高到閾值時(shí)，可作為調(diào)節(jié)亞基與催化亞基CDK結(jié)合形成復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的運(yùn)行。當(dāng)一些增殖信號(hào)(生長(zhǎng)因子、絲裂原等)與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后，可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)CyclinD1的合成，CyclinD1與CDK4相結(jié)合后，使抑制蛋白(Rb)磷酸化而喪失抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F的作用，游離的E2F激活DNA合成基因，促使細(xì)胞從G0進(jìn)入G1期[6]。除了促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行分裂外，研究還發(fā)現(xiàn)，CyclinD1可以結(jié)合組蛋白去乙?；?P/CAF，亦可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD[7]等，通過(guò)和這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，起到促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行的作用，而起過(guò)度表達(dá)則可致細(xì)胞增殖失控而發(fā)生惡性化。

PCNA也是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，但它不與CDK相結(jié)合，而是作為DNA聚合酶的附屬蛋白，促進(jìn)DNA的延伸，在G1晚期，其表達(dá)大幅度增加，S期達(dá)到高峰，G2～M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，檢測(cè)其在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[8]。

p21kip1能特意抑制CDK蛋白的功能，對(duì)細(xì)胞有抑制作用，一旦細(xì)胞受到毒素或輻射損害，p21kip1可與CyclinD/CDK結(jié)合并抑制其活性，減少pRb蛋白磷酸化，引起G1期阻滯促進(jìn)修復(fù)，調(diào)控細(xì)胞周期確保遺傳物質(zhì)精確的傳遞給下一代，以消除DNA損傷而引發(fā)腫瘤[9]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏藥濕生扁蕾作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較， CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達(dá)減少，p21kip1·mRNA的表達(dá)增多，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。說(shuō)明濕生扁蕾引起結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡可能與其抑制CyclinD1、CDK4、PCNA mRNA的表達(dá)和促進(jìn)p21kip1·mRNA的表達(dá)有關(guān)，而通過(guò)濕生扁蕾對(duì)SW480細(xì)胞周期及增殖的調(diào)控可能有助于對(duì)結(jié)腸癌患者的病情治療。

[1] 李連弟, 趙平, 孔靈芝. 中國(guó)部分市、縣惡性腫瘤的發(fā)病與死亡(第三卷)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2007. 250-251.

[2] 李寶國(guó). 結(jié)腸癌診治的回顧與展望. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)[J], 2010, 31(13):2124-2125.

[3] 景明, 羅永皎, 劉喜平,等. 藏藥濕生扁蕾提取物的止瀉作用及其急性毒性研究[J]. 中成藥, 2011, 33 (6):1049-1050.

[4] 曹長(zhǎng)年, 米琴, 趙宙興,等. 藏藥濕生扁蕾有效成分的研究[J]. 青海農(nóng)林科技, 2004 (3):12.

[5] 王建枝, 殷蓮華主編. 病理學(xué)生理學(xué)第8版, 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2013. 10:129-133.

[6] Coqueret O. Linking Cyclins to transcription control[J]. Gene, 2002, 299: 35-55.

[7] Adnane J, Shao Z, Robbins PD. Cyclin D1 associates with the TBP associated factor TAF( Ⅱ) 250 to regulate Sp1 mediated transcrip-tion. Oncogene, 1999, 18: 239-247.

[8] 李宏, 廉斌, 王建,等. Topo11、P170、GST-π、PCNA及E-Cadherin在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志, 2013(1):12-15.

[9] 馬建安, 焦昌安, 陳剛,等. 染色體9p21基因單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族人群冠心病的關(guān)系 [J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(12):1638-1642.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)81360522)。

王雅莉(1975-)，女，副教授。研究方向：免疫與分子生物學(xué)。

景明(1963-)，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：中藏藥新制劑開(kāi)發(fā)研究。

R29

A

1007-8517(2014)03-0001-02

2013.12.16)