孟慶彬，于健春，康維明，馬志強，周 立，葉 欣，曹戰(zhàn)江，田樹波中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京00730

2武漢市第一醫(yī)院胃腸外科，武漢430022

胃癌是中國第2位常見的腫瘤相關(guān)死亡原因［1］，侵襲特性導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差，闡明胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制對于胃癌治療具有重要意義。真核翻譯起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2，EIF5A2)作為可能的癌基因在卵巢癌［2-3］、膀胱癌［4］、肺癌［5］、肝癌［6］、結(jié)直腸癌［7-8］、胰腺癌［9］及黑色素瘤［10］等多種人類腫瘤中表達異常升高并通過多種途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤細胞遷移及侵襲［11］?；蚪M篩查發(fā)現(xiàn)，EIF5A2在預(yù)測胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可能發(fā)揮重要作用［12］，但EIF5A2在胃癌細胞增殖和遷移侵襲過程中的作用機制鮮有報道。本研究采用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染MKN28細胞，評估了抑制EIF5A2對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其可能的分子機制。

材料和方法

材料及試劑MKN28、HGC27人胃癌細胞由北京協(xié)和醫(yī)院基本外科實驗室保存。永生化正常胃黏膜上皮細胞 (immortalized gastric mucosal epithelial cells，GES-1)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。胃癌及匹配的非癌正常胃黏膜新鮮組織由2例于北京協(xié)和醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的胃中-低分化腺癌患者獲得，并獲得患者知情同意及北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會授權(quán)。BCA蛋白濃度檢測試劑盒和ECL發(fā)光劑購自美國Thermo公司，細胞計數(shù)試劑盒 (cell counting kit-8，CCK-8)購自日本Dojindo公司，RPMI-1640及胎牛血清購自美國Gibco公司，EIF5A2、C-myc兔單克隆抗體購自美國Epitomics公司，E-cadherin、vimentin、Cyclin D1、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白-1(metastasis-associated protein 1，MTA1)兔單克隆抗體及Cyclin D3鼠單克隆抗體購自美國CST公司，GAPDH兔多克隆抗體購自美國Santa cruz公司，山羊抗鼠和抗兔抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;引物、siRNA、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、超純RNA提取試劑盒，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購自美國Invitrogen公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司;PVDF膜購自Amersham Biosciences公司。

siRNA的設(shè)計及合成3對EIF5A2 siRNA及對照siRNA均由美國Invitrogen公司設(shè)計合成，其序列分別為:(1)siRNA#1:正義鏈 5’-GCUUCCAGCACUUAC CCUATT-3’，反義鏈 5’-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3’;(2)siRNA#2:正義鏈5’-GGUUCACCUUGUUGGAA UUTT-3’，反義鏈 5’-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3’;(3)siRNA#3正義鏈5’-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3’，反義鏈 5’-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3’;(4)對照 siRNA:正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;反義鏈 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞 (MKN28、HGC27及GES-1)并接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2、95%濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。實時熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)法及 Western blot法檢測 EIF5A2表達水平，選取EIF5A2高表達細胞株進行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染前24 h接種胃癌細胞于6孔板內(nèi)，每孔接種4×105個細胞，24 h后約長滿60%進行轉(zhuǎn)染實驗。設(shè)置siRNA#1、siRNA#2、siRNA#3、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組以及空白對照組(H2O代替siRNA)，每孔siRNA與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的比例為100 pmol∶5 μl，轉(zhuǎn)染6 h后更換細胞培養(yǎng)基;24 h后提取總RNA，48 h后提取總蛋白;轉(zhuǎn)染24 h后進行細胞增殖、遷移及侵襲實驗。

CCK-8法檢測細胞增殖設(shè)EIF5A2 siRNA轉(zhuǎn)染組和對照siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染siRNA至6孔板MKN28細胞，每組3個重復(fù)孔;孵育24 h后消化計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，取100 μl接種于96孔板內(nèi)孵育;分別于貼壁后0、24、48、72 h每孔加入10 μl CCK-8，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h;酶標(biāo)儀上用450 nm波長測定吸光度，計算實驗組和對照組之間吸光度值的差異。

Transwell法檢測細胞遷移及侵襲能力細胞遷移能力檢測:實驗分組如上，每組3個重復(fù)孔;轉(zhuǎn)染24 h后，消化重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為2.5×105/ml;于Transwell板下室內(nèi)加入500 μl含20%血清完全培養(yǎng)基，上室加入200 μl細胞懸液，培養(yǎng)24 h后棄去陳舊培養(yǎng)基，用棉簽輕輕拭去上室內(nèi)未遷移細胞;甲醇固定，蘇木素伊紅染色;倒置顯微鏡下觀察，選5個代表區(qū)域，200倍鏡下計數(shù)，取均值。細胞侵襲能力檢測:Matrigel膠預(yù)先包被Transwell板上室基底膜，細胞鋪板前水化基底膜;細胞接種濃度5×105/ml，余方法同細胞遷移實驗。

qRT-PCR法檢測RNA干擾對EIF5A2表達的影響siRNA轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，TRIzol法提取細胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成EIF5A2 cDNA(EIF5A2引物序列:正義鏈:5’-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3’，反義鏈:5’-GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3’)。采用熒光定量PCR儀進行 qRT-PCR，主要程序:95℃10 min;95℃ 15 s，40個循環(huán);60℃ 1 min。每個樣本設(shè)3個副孔。GAPDH mRNA作為內(nèi)參對照 (引物序列:正義鏈:5’-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反義鏈:5’-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3’)。

Western blot法檢測RNA干擾對EIF5A2及可能靶蛋白表達的影響 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞提蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每孔60 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉;洗膜，一抗孵育 (兔抗人EIF5A2單抗，兔抗人GAPDH多抗，均1∶1000稀釋)，4℃冰箱中搖床上過夜;次日洗膜，二抗室溫孵育1 h(HRP標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠二抗，1∶3000稀釋);洗膜，行辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光增強劑顯色反應(yīng)，顯像。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料組間比較如滿足方差齊則采用雙側(cè)Studentt檢驗，不滿足方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)比較則采用Satterthwaite近似t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，雙向P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

EIF5A2在MKN28、HGC27、GES-1細胞及人胃癌和非癌正常胃黏膜組織內(nèi)的表達qRT-PCR法及Western blot檢測結(jié)果顯示:EIF5A2 mRNA及蛋白在MKN28胃癌細胞內(nèi)表達水平最高，在GES-1細胞內(nèi)表達水平最低;EIF5A2蛋白在2例人胃癌組織的表達均明顯高于在匹配的非癌正常胃黏膜組織的表達(圖1)。

3對EIF5A2 siRNA對EIF5A2 mRNA及編碼蛋白的抑制效果與空白對照組比較，轉(zhuǎn)染24 h后，EIF5A2 siRNA#1(P=2.0×10-4)、siRNA#2轉(zhuǎn)染組(P=0.002)EIF5A2 mRNA表達水平均明顯下降，其中以siRNA#1轉(zhuǎn)染組下降最明顯，但control siRNA(P=0.570)及EIF5A2 siRNA#3轉(zhuǎn)染組 (P=0.231)EIF5A2 mRNA表達水平較空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA#1、siRNA#2轉(zhuǎn)染組EIF5A2蛋白表達水平均較對照組下調(diào)，其中以siRNA#1轉(zhuǎn)染組下降最明顯(圖 2)。

EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對MKN28細胞增殖能力的影響在細胞接種后0 h，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組與control-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力 (A450吸光度值)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.612);在細胞接種后的24(P=0.003)、48(P＜0.001)、72 h(P＜0.001)，與control-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力均明顯減弱 (圖3)。

EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對胃癌細胞MKN28遷移、侵襲能力的影響與control-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染后明顯抑制了MKN28遷移能力(P＜0.001)和侵襲能力 (P＜0.001)(圖4)。

圖1 EIF5A2在胃癌細胞、永生化正常胃黏膜上皮細胞及人胃癌和非癌胃黏膜組織內(nèi)的表達Fig 1 Expressions of EIF5A2 in human gastric cancer cell lines and the immortalized gastric mucosal epithelial cell line，gastric adenocarcinoma and the paired distant non-tumor tissues

EIF5A2-siRNA#1對MKN28細胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達的影響與對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組EIF5A2、Cyclin D1、Cyclin D3蛋白及MTA1和C-myc蛋白表達均明顯下調(diào)，同時EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組間質(zhì)指標(biāo)Vimentin表達明顯下調(diào)，E-cadherin表達呈上調(diào)趨勢;對照siRNA轉(zhuǎn)染組與EIF5A2 siRNA#1轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶-9(metallopeptidase-9，MMP-9)表達水平無明顯差異 (圖5)。

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染對EIF5A2 mRNA及蛋白表達的影響Fig 2 Effects of siRNA transfection on EIF5A2 mRNA and protein expressions

圖3 EIF5A2-siRNA轉(zhuǎn)染對MKN28細胞增殖的影響Fig 3 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on proliferation of MKN28 cells

圖4 EIF5A2-siRNA轉(zhuǎn)染對MKN28遷移、侵襲能力的影響Fig 4 Effects of EIF5A2-siRNA transfection on the migration and invasion of MKN28 cells

圖5 EIF5A2-siRNA#1轉(zhuǎn)染對MKN28細胞內(nèi)EIF5A2可能靶蛋白表達的影響Fig 5 Effects of EIF5A2-siRNA#1 transfection on the expressions of possible targeting proteins of EIF5A2 in MKN28 cells

討 論

EIF5A2基因定位在人類染色體3q26.2區(qū)，其編碼產(chǎn)物作為可能的癌蛋白在多種人類腫瘤內(nèi)高表達，并與其增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和/或預(yù)后密切相關(guān)［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制EIF5A2可明顯抑制MKN28細胞的增殖能力，提示EIF5A2蛋白可能是促進MKN28細胞增殖的重要分子。有研究顯示，EIF5A2與肝癌細胞、卵巢癌細胞及結(jié)直腸癌細胞的增殖也密切相關(guān)［2，7，13］，但EIF5A2調(diào)控腫瘤細胞增殖的分子機制尚未闡明。Cyclin D1及Cyclin D3在調(diào)控細胞周期，促進胃癌細胞增殖方面可發(fā)揮重要作用［14-15］。本研究結(jié)果顯示，抑制EIF5A2可明顯下調(diào)MKN28細胞內(nèi)Cyclin D1和Cyclin D3的表達水平，提示EIF5A2調(diào)控Cyclin D1和Cyclin D3可能是促進胃癌細胞增殖的機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，抑制EIF5A2可明顯降低MKN28胃癌細胞遷移及侵襲能力。2007年，Marchet等［12］通過基因組篩查法證實EIF5A2基因在預(yù)測胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可發(fā)揮重要作用。近期研究顯示，EIF5A2-MTA1/C-myc軸在結(jié)直腸癌細胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。此外有研究證實，EMT程序和MTA1及C-myc分子與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［16-18］。據(jù)此，本研究進一步觀察了 siRNA抑制EIF5A2對MKN28細胞內(nèi)MTA1、C-myc及 EMT相關(guān)指標(biāo)Vimentin和E-cadherin表達的可能影響，結(jié)果證實抑制EIF5A2可明顯抑制MTA1、C-myc及間質(zhì)指標(biāo)Vimentin并上調(diào)上皮指標(biāo)E-cadherin的表達水平。

綜上，本研究結(jié)果顯示，siRNA抑制EIF5A2可明顯抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。EIF5A2上調(diào)CyclinD1和Cyclin D3可能是促進MKN28胃癌細胞增殖的可能機制之一;EIF5A2上調(diào)C-myc、MTA1以及調(diào)控EMT可能是促進MKN28胃癌細胞遷移及侵襲的重要機制之一。

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