洪衛(wèi) 林寶釵 張貝貝 毛偉敏 張沂平

晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者腫瘤組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor recetor, EGFR）突變是酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）最重要的療效預測指標[1]，但常常因各種原因?qū)е碌哪[瘤組織量太少以致EGFR突變狀態(tài)未明，ISEL研究的數(shù)據(jù)中能夠獲得足量腫瘤組織標本進行EGFR突變檢測標本的患者僅約20%[2]。BR21[3]、TITAN[4]和INTEREST[5]等臨床研究顯示了厄洛替尼和吉非替尼在晚期EGFR突變未明NSCLC患者二、三線治療中的療效。目前NCCN指南指出在二線及二線以上治療時，對EGFR突變狀態(tài)未明的患者可以選擇TKI，如何對這些患者進行治療前的療效預估是我們面臨的臨床難題。研究[6]發(fā)現(xiàn)，TKI的一個重要作用機制是誘導腫瘤細胞凋亡。GNAS1基因位于20號染色體，包含13個外顯子，其中T393C多態(tài)性與腫瘤組織Gs蛋白α亞單位mRNA表達增加相關(guān)[7]。而且，Gs蛋白α亞單位表達增加會促進凋亡發(fā)生[8]。本研究探索晚期NSCLC患者EGFR突變未明TKI近期療效與促凋亡基因GNAS1基因T393C多態(tài)性的關(guān)系，報告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象 浙江省腫瘤醫(yī)院化療中心2009年1月-2012年4月間收治的116例晚期NSCLC患者，經(jīng)組織學或細胞學確診的NSCLC，具有可測量病灶，肝腎功能不超過1度異常，既往經(jīng)過一至二線化療后病情進展，各種原因?qū)е聼o法明確患者腫瘤組織EGFR突變狀態(tài)，均可考慮入組接受二線或三線EGFR-TKI靶向治療。排除標準為：既往患間質(zhì)性肺病、藥物誘導的間質(zhì)性疾病、需要激素治療的放射性肺炎或任何具臨床證據(jù)的活動性間質(zhì)性肺?。换€時CT掃描發(fā)現(xiàn)存在特發(fā)性肺纖維化；沒有完全控制的眼部炎癥或眼部感染，或任何可能導致上述眼部疾病的情況；既往有明確的神經(jīng)或精神障礙史，包括癲癇或癡呆；混有小細胞肺癌成分的患者。

所有研究對象采血前均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 方法 抽取患者治療前外周靜脈全血2 mL，EDTA抗凝，采用全血基因組DNA提取試劑盒（康為世紀公司），按照說明書進行基因組DNA提取，提取后-80oC冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ米贤夥止夤舛扔嫓y定DNA濃度和純度。OD260/OD280比值的參考值為1.8-2.0。

1.2.1 PCR 擴增 引物序列為：上游引物5′-CTCCTAACTGACATGGTGCAA-3′，下游引物5′-TAAGGCCACACAAGTCGGGGT-3′。PCR反應總體積為25 μL，2*GoldStar Taqman Mixture（with ROX） 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，樣本2 μL，去離子水8.5 μL。PCR 的反應條件為：95oC×10 min預變性；95oC×30 s變性，60oC×30 s退火，72oC×60 s延伸，72oC×5 min終延伸，35個循環(huán)。本實驗已設空白對照孔，每個樣本均設置復孔。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳體系 將TAE 緩沖液、1%瓊脂糖、溴化乙錠（0.5 μg/mL）在電壓120 V的瓊脂糖凝膠電泳體系電泳60 min。

1.3 療效評價標準 療效評定采用實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST 1.1）[9]，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、穩(wěn)定（stable disease, SD）和進展（progressive disease, PD）?？陀^緩解率（objectiveresponse rate, ORR）=（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）×100%。疾病控制率（disease control rate, DCR）=（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）×100%。

表1 患者的一般臨床特征Tab 1 General clinical characteristics of the patients

1.4 隨訪和生存分析 隨訪采用門診、電話或書信方式，末次隨訪時間為 2012年11月30日。無進展生存期（progression-free survival, PFS）定義為患者自接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療開始至疾病進展、死亡或不良反應不可耐受。對于在隨訪截止日期無進展的病例，在統(tǒng)計時作截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，分析基因多態(tài)性與療效評價的關(guān)系采用χ2檢驗，單因素分析PFS采用Kaplan-Meier生存曲線分析及Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox分析法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床特征 入組患者共116例，其中共41例患者服用吉非替尼（易瑞沙）250 mg，每天1次口服治療；75 例患者服用厄洛替尼（特羅凱）150 mg，每天1次口服治療。所有患者具體臨床特征詳見（表1）。

2.2 GNAS1基因多態(tài)性檢測結(jié)果判定 擴增出的目的基因為GNAS1基因的一個片段，長度為345 bp，這個片段中可能含有限制性內(nèi)切酶FokI的酶切識別位點：5′-CGATG(N)9↓-3′，3′-CCTAC(N)13↑-5′。用FOKI酶切GNAS1基因片段：將該反應體系放入37oC恒溫水浴箱中5 h后，用1.5%的瓊脂糖凝膠150 V電泳30 min，觀察酶切圖譜。有些PCR產(chǎn)物的核苷酸鏈中的ATT轉(zhuǎn)換為ATC，可被FOKI識別而切為259 bp和86 bp兩段。條帶被完全切開后的259 bp，即為GNAS1基因的CC型；條帶未被酶切的345 bp片段，為TT型；條帶為雙鏈DNA片段一條被酶切，一條未切開的產(chǎn)物酶譜，為GNAS1基因TC型（圖1）。

2.3 GNAS1基因片段多態(tài)性與TKI治療ORR的關(guān)系 所有患者共116例，總有效率29.3%，其中GNAS1基因T393C基因型為TT型、CT型及CC型分別為46例、57例和13例，有效率分別為38.5%、33.3%和21.7%，GNAS1基因各基因型患者間的有效率無明顯差異。相比GNAS1基因其它基因型，CC型疾病控制率更低（46.2% vs 73.8%,P=0.039）（表2）。

2.4 單因素分析PFS 單因素分析中位PFS，GNAS1基因型為CC型中位PFS短于其它基因型（2.3個月 vs 6.0個月，P=0.005），而女性長于男性（10.2個月 vs 4.6個月，P=0.04）；不吸煙者長于有吸煙史者（11.9個月 vs 2.5個月，P＜0.001）；病理類型為腺癌長于其他類型（11.9個月 vs 4.1個月，P＜0.001），均存在統(tǒng)計學差異，見表3和圖2。

2.5 多因素分析PFS 多因素分析結(jié)果顯示，包括PS評分、吸煙史和病理類型在內(nèi)，GNAS1基因T393C多態(tài)性為PFS的獨立預后因素（P=0.006），見表4。

3 討論

小分子TKI是晚期NSCLC 21世紀最重要的治療進展，腫瘤組織EGFR突變是最重要的療效預測因子[1]，中國的OPTIMAL[10]、日本的WJTOG3405[11]和NEJ002[12]及歐洲EURTAC[13]等多項III期隨機對照研究結(jié)果顯示EGFR突變的晚期NSCLC，接受TKI治療的有效率可以高達58%-82%，明顯高于傳統(tǒng)的第3代化療新藥與鉑的兩藥聯(lián)合治療，PFS也較化療組明顯延長。

表2 GNAS1基因T393C基因多態(tài)性與TKI治療療效的關(guān)系Tab 2 Relationship between GNAS1 T393C gene polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor (TKI)

表3 單因素分析無進展生存時間Tab 3 Univariate analysis of progression-free survival (PFS)

然而，臨床實踐過程中，多數(shù)的晚期NSCLC患者因腫瘤組織采集困難、患者依從性差等多種原因?qū)е聼o法取得足夠的腫瘤組織量進行EGFR突變狀態(tài)檢測，臨床上能夠獲得基因突變檢測標本的患者僅約20%（來自ISEL研究的數(shù)據(jù)）[2]。

對這些EGFR突變狀態(tài)未明的患者，療效預測目前主要依賴一些臨床因素，如亞裔、女性、不吸煙、腺癌等[14]。如何對這些患者進行治療前的療效預估是我們臨床實踐中面臨的難題。

多項基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，TKI誘導腫瘤細胞凋亡可能是其重要的作用機制之一，研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因，如BIM基因[15,16]、Bcl-2基因[17]參與TKI誘導的細胞凋亡。不論吉非替尼還是厄洛替尼都可在腫瘤細胞內(nèi)通過Bcl-2/Bcl-xL復合體來調(diào)節(jié)下游的IP3R3蛋白導致腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡抵抗[18]，敲除BCL-2基因可以增加腫瘤細胞對TKI的敏感性[17]。

表4 多因素分析PFSTab 4 Multivariate analysis of PFS

圖1 GNAS1基因T393C多態(tài)性判定圖。在凝膠成像系統(tǒng)掃描中最左側(cè)為maker電泳通道，GNAS1基因的基因型為第1、4、7通道為TC型，第2、3、5為CC型，第6通道為TT型。Fig 1 GNAS1 T393C gene polymorphism detection result diagram. The leftmost of the gel imaging system is maker electrophoresis channel, the 1, 4 and 7 passage is TC genotype, channel 2, 3 and 5 represents CC genotype, channel 6 is TT genotype.

圖2 單因素分析GNAS1基因T393C多態(tài)性與PFS的關(guān)系Fig 2 Univariate analysis of the relationship between PFS and GNAS1 T393C gene polymorphism

GNAS1基因位于20號染色體，包含13個外顯子，其中T393C多態(tài)性與腫瘤組織Gs蛋白α亞單位mRNA表達增加相關(guān)[7]。而且，Gs蛋白α亞單位表達增加會促進凋亡發(fā)生[8]。

本研究所有樣本共116例，其中GNAS1基因CC患者有13例，ORR為30.8%，但DCR為46.2%；TT型患者46例，CT型患者57例，ORR分別為23.9%和33.3%，而DCR分別為65.2%和80.7%。在疾病控制率方面，CC型對比GNAS1的其它基因型更低，提示預后差（DCR: 46.2% vs 73.8%, P=0.039），女性、不吸煙、腺癌患者是TKI治療的優(yōu)勢人群。單因素分析中位PFS，女性長于男性（10.2個月 vs 4.6個月，χ2=4.24，P=0.04）；不吸煙者長于有吸煙史者（11.9個月 vs 2.5個月，χ2=15.28，P＜0.001）；病理類型為腺癌長于其他類型（11.9個月 vs 4.1個月，χ2=13.06，P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。研究還發(fā)現(xiàn)GNAS1基因型為CC型者預后差，中位PFS短于其它基因型的患者（2.3個月 vs 6.0個月，P=0.005）。多因素分析結(jié)果也證實GNAS1基因T393C基因多態(tài)性為PFS的獨立預后因素。其他研究[19]也發(fā)現(xiàn)，CC型腫瘤患者的易于復發(fā)，我們的既往研究發(fā)現(xiàn)GNAS1基因T393C多態(tài)性TT型與吉西他濱為基礎(chǔ)的較好的化療療效相關(guān)[20]。

因此，本研究結(jié)果進一步從臨床中證實了GNAS1基因T393C多態(tài)性能夠作為預測EGFR突變未明NSCLC患者TKI治療的療效的指標之一。我們推測GNAS1基因型為CC的患者，由于影響了TKI誘導細胞凋亡通路，導致近期療效欠佳，具體的機制值得進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)不同GNAS1基因型患者間的近期有效率并無統(tǒng)計學意義。在EGFR突變未明的中國患者，GNAS1 T393C基因型為CC占比為11.2%，因不同人群和不同種族可能會存在基因突變頻率的差異。

本研究為回顧性研究，且樣本量有限，有待后續(xù)更深入研究及期待前瞻性多中心的大型臨床研究為肺癌的治療提供更高級別的循證醫(yī)學證據(jù)。