朱 珠 陳 敏 張曉琦 張 斌 丁希偉 楊 燕 鄒曉平

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

腫瘤細胞不同于正常細胞，即使在氧氣充足的條件下，仍主要依賴糖酵解代謝，消耗大量葡萄糖并產(chǎn)生乳酸，腫瘤細胞這種活躍的有氧糖酵解代謝特性被稱為“Warburg效應”[1]。研究顯示M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2, PKM2)在大多數(shù)的腫瘤細胞中高表達。近年來，隨著腫瘤代謝機制的深入研究，關于PKM2的研究成為熱點。大量研究證實PKM2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。然而，PKM2在胃癌細胞中的作用尚不明確。本研究通過RNA干擾技術沉默人胃癌細胞株SGC-7901中PKM2的表達，觀察對胃癌細胞體外增殖、凋亡、遷移、侵襲以及糖酵解水平的影響，旨在為PKM2成為胃癌臨床治療的潛在靶點提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胃腺癌中分化細胞株SGC-7901、人胃腺癌低分化細胞株BGC-823由南京鼓樓醫(yī)院腫瘤科惠贈，人永生化胃黏膜上皮細胞株GES-1、人宮頸癌細胞株HeLa為本實驗室所保存。PKM2 siRNA干擾質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司)，兔抗人PKM2(D78A4)XP?單克隆抗體、兔抗人β-actin(13E5)單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)，山羊抗兔二抗(杭州聯(lián)科生物技術有限公司)，Alexa Fluor?594山羊抗兔IgG(H+L)(Invitrogen公司)，DAPI、葡萄糖檢測試劑盒(Sigma-Aldrich公司)，CCK-8細胞增殖/細胞毒性檢測試劑盒[東仁化學科技(上海)有限公司]，Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(eBioscience 公司)，Matrigel(BD公司)，Transwell小室(Corning 公司)，乳酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)，乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)：SGC-7901、BGC-823、GES-1、HeLa細胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內，常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2. siRNA轉染：取對數(shù)生長期SGC-7901細胞接種于6孔板，待細胞密度達80%左右準備轉染。按LipofectamineTM2000轉染試劑說明書，分別轉染空載體pU6質粒(空載體組)和PKM2 siRNA干擾質粒(PKM2 siRNA組)，以400 μg/mL G418培養(yǎng)液進行高轉染效率細胞株篩選2周，收集細胞進行后續(xù)實驗。

3. 蛋白質印跡法檢測PKM2蛋白、糖酵解相關基因表達：①收集對數(shù)生長期SGC-7901、BGC-823、GES-1、HeLa細胞；②常規(guī)培養(yǎng)未轉染組、空載體組、PKM2-siRNA組細胞，48 h收集細胞。預冷PBS洗滌2次，加蛋白裂解液冰上裂解，4 ℃ 15 294×g離心10 min，取上清，行蛋白定量檢測。取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離1～2 h，蛋白轉移至PVDF膜，5% BSA封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的PKM2、葡萄糖轉運蛋白-1(Glut-1)、乳酸脫氫酶A(LDHA)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗孵育2 h，TBST洗滌，暗室曝光，掃描圖像，Quantity One 4.6.2凝膠定量軟件分析目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，結果取平均值。

4. Real-time PCR檢測PKM2 mRNA表達：取未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組SGC-7901細胞，加入1 mL Trizol提取總RNA。按Takara PCR逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。采用SYBR Green 熒光法定量檢測PKM2 mRNA表達，qPCR引物序列由Invitrogen公司合成。PKM2引物上游：5’-AGT ACC ATG CGG AGA CCA TC-3’，下游：5’-GCG TTA TCC AGC GTG ATT TT-3’；以β-actin作為內參照，引物上游：5’-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3’，下游：5’-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3’。每組設3個復孔，每次實驗至少重復3次，所得結果以2-△△Ct法分析。

5. 免疫熒光法檢測PKM2在細胞內的表達和分布：將空載體組、PKM2 siRNA組細胞接種于24孔板(105/孔，0.5 mL)，常規(guī)培養(yǎng)48 h。PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min，山羊血清封閉1 h，加入1∶100稀釋的PKM2一抗孵育過夜，PBS洗滌，加入熒光二抗孵育1 h，加入DAPI(2 μg/mL)染核5 min，1 h內于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

6. CCK-8法檢測細胞增殖：將未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞接種于96孔板，每組設4個復孔，設置空白孔，培養(yǎng)24或48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后孵育1 h，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度值(A值)，細胞相對增殖率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

7. 流式細胞分析檢測細胞凋亡：將未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞培養(yǎng)48 h，每組設3個復孔。收集細胞，按Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作， 以流式細胞儀檢測細胞凋亡。

8. 細胞遷移、侵襲能力檢測：取胰酶消化空載體組和PKM2 siRNA組細胞，調整細胞密度至1×105/mL。對于細胞侵襲，需先用Matrigel 1∶8稀釋液30 μL包被上室面。將小室放置于24孔板，下室添加500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室用PBS清洗，甲醇固定15 min，PBS清洗，濕棉簽小心擦去小室表面細胞。每孔加入500 μL 0.1%結晶紫，室溫30 min，PBS清洗，倒置風干。每組細胞設立3個平行復孔，實驗重復3次。

9. 分光光度法檢測細胞外葡萄糖、乳酸濃度以及細胞內LDH活性：將未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞培養(yǎng)48 h，每組設3個復孔。收集細胞和培養(yǎng)基，參照試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸濃度和細胞內LDH活性。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、PKM2在人胃腺癌細胞中呈高表達

PKM2在GES-1細胞中呈相對低表達，在SGC-7901、BGC-823、HeLa細胞中呈高表達(圖1)。PKM2在不同細胞株中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本實驗選取人胃腺癌SGC-7901細胞作為研究對象。

二、驗證PKM2 siRNA的干擾效果

1. PKM2 siRNA轉染SGC-7901細胞對PKM2 mRNA和蛋白表達的影響：用Real-time PCR、蛋白質印跡法分別驗證siRNA干擾PKM2后mRNA、蛋白表達，結果顯示PKM2 siRNA組與未轉染組和空載體組相比，PKM2 mRNA、蛋白表達明顯降低(P<0.05)(圖2、圖3)。

*P<0.05

2. PKM2 siRNA轉染SGC-7901細胞后對PKM2蛋白定位表達的影響：免疫熒光法檢測可見細胞內PKM2蛋白定位發(fā)生變化。PKM2 siRNA轉染前PKM2蛋白主要定位于細胞質，而轉染后細胞內PKM2蛋白明顯減弱(圖4)，提示PKM2 siRNA靶向干擾的有效性。

三、轉染PKM2 siRNA對SGC-7901細胞增殖的影響

細胞培養(yǎng)24 h后，PKM2 siRNA組較未轉染組和空載體組細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)時間延長，差異更為顯著(P<0.05)(圖5)，提示PKM2可促進SGC-7901細胞增殖。

四、轉染PKM2 siRNA對SGC-7901細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測顯示，未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞早期凋亡率分別為(4.82±1.39)%、(7.16±1.43)%、(27.03±1.46)%(圖6)。PKM2 siRNA組細胞早期凋亡率明顯高于未轉染組和空載體組(P<0.05)，提示PKM2有抑制胃癌細胞早期凋亡的作用。

五、轉染PKM2 siRNA對SGC-7901細胞遷移和侵襲能力的影響

圖1 不同細胞株PKM2蛋白的表達(蛋白質印跡法)

*P<0.05

圖4 PKM2 siRNA 轉染SGC-7901細胞后對細胞內PKM2蛋白定位變化的影響(免疫熒光法，×200)

PKM2 siRNA組較空載體組遷移和侵襲的細胞數(shù)目明顯減少，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖7)，提示PKM2可促進SGC-7901細胞的遷移、侵襲。

六、轉染PKM2 siRNA對SGC-7901有氧糖酵解的影響

未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞培養(yǎng)48 h，提取總蛋白檢測，結果顯示PKM2 siRNA組較未轉染組、空載體組細胞的Glut-1和LDHA蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)(圖8A)。

未轉染組、空載體組、PKM2 siRNA組細胞培養(yǎng)48 h，檢測細胞液內葡萄糖、乳酸濃度以及細胞內LDH活性，結果顯示PKM2 siRNA組細胞葡萄糖攝取率、乳酸產(chǎn)量、LDH活性較未轉染組、空載體組細胞明顯減低 (P<0.05)(圖8B～D)。

*P<0.05

圖6 PKM2 siRNA 轉染對SGC-7901細胞凋亡的影響(流式細胞術)

A：光鏡下觀察穿透小室細胞數(shù)目(結晶紫染色，×100)；B：柱形圖

*P<0.05

討 論

丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)是糖酵解通路中最后一個限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)去磷酸化，產(chǎn)生丙酮酸和ATP。PK在哺乳動物中存在四種亞型：PKL、PKR、PKM1以及PKM2，PKM2主要表達于胚胎組織以及高增殖細胞，尤其是腫瘤細胞中。PKL/R/M1在體內主要以穩(wěn)定的高活性的四聚體形式存在，而PKM2在體內可以三種形式存在，單體、二聚體和四聚體。PKM2在腫瘤細胞中主要以低活性的二聚體形式存在[3]，可以單體形式移位至細胞核，調控細胞周期進展和Warburg效應[4]。

細胞增殖對于碳骨架和NADPH的需求遠遠高于對ATP的需求，低活性的PKM2可以為腫瘤細胞提供充分的代謝中間產(chǎn)物用于糖酵解旁路如磷酸戊糖途徑[5]。PKM2可以平衡腫瘤細胞生長和能量供給的關系，是腫瘤細胞增殖的開關和增殖的速度調節(jié)器[6]。

PKM2除了作為糖酵解酶主要定位于細胞質外，在某些情況下，可以單體形式遷移入細胞核。人腫瘤細胞表皮生長因子受體(EGFR)活化可誘導PKM2向核內轉移，與β-catenin結合，促進細胞周期蛋白D1和c-Myc表達[7]。此外，PKM2在核內有蛋白激酶的功能，能在705酪氨酸位點磷酸化STAT3，促進MEK5轉錄激活[8]；與組蛋白H3結合，磷酸化11位點的蘇氨酸，促進HDAC3從CCND1和MYC基因啟動子解離，促進細胞周期蛋白D1和c-Myc表達，進而促進腫瘤細胞生長，加速細胞周期進程和腫瘤的發(fā)生[9]。

本實驗利用RNA干擾技術沉默胃癌SGC-7901細胞PKM2后，細胞增殖、抗凋亡、遷移以及侵襲能力明顯減弱，糖酵解相關基因Glut-1、LDHA表達明顯受抑制，葡萄糖攝取率、LDH活性以及乳酸產(chǎn)量明顯減低，提示PKM2與胃癌發(fā)生發(fā)展以及糖酵解密切相關。實驗選取PKM2較GES-1細胞表達輕度偏高的胃癌SGC-7901細胞作為研究對象，提示PKM2輕度升高即可以對腫瘤生長和代謝起到重要作用。PKM2在胃癌不同分化程度的細胞株中表達有顯著的差異，腫瘤代謝的差異可能是導致其不同分化程度以及增殖、轉移能力的原因之一，有待進一步研究證實。

隨著PKM2在腫瘤代謝、進展中的作用逐漸被認識，有關PKM2的研究也逐漸深入。腫瘤細胞有多種方式調節(jié)PKM2表達和活性，包括轉錄水平的調節(jié)，選擇性剪切，翻譯后修飾，變構調節(jié)等，以利于腫瘤細胞的生長[10-11]。此外，PKM2作為一種蛋白激酶，可間接調控其他代謝酶和細胞周期相關蛋白，其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。PKM2 siRNA的可能作用機制是通過影響糖酵解，打破細胞供能與生物大分子合成的平衡，或是抑制了細胞周期蛋白和c-Myc的表達，也可能存在其他仍不明確的機制，需進一步研究?？傊琍KM2有望成為胃癌治療的潛在靶點之一。

1 Warburg O. On the origin of cancer cells[J]. Science, 1956, 123 (3191): 309-314.

2 Mazurek S, Boschek CB, Hugo F, et al. Pyruvate kinase type M2 and its role in tumor growth and spreading[J]. Semin Cancer Biol, 2005, 15 (4): 300-308.

3 Mazurek S. Pyruvate kinase type M2: a key regulator within the tumour metabolome and a tool for metabolic profiling of tumours[J]. Ernst Schering Found Symp Proc, 2007, (4): 99-124.

4 Yang W, Zheng Y, Xia Y, et al. ERK1/2-dependent phosphorylation and nuclear translocation of PKM2 promotes the Warburg effect[J]. Nat Cell Biol, 2012, 14 (12): 1295-1304.

5 Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation[J]. Science, 2009, 324 (5930): 1029-1033.

6 Mazurek S. Pyruvate kinase type M2: a key regulator of the metabolic budget system in tumor cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011, 43 (7): 969-980.

7 Yang W, Xia Y, Ji H, et al. Nuclear PKM2 regulates beta-catenin transactivation upon EGFR activation[J]. Nature, 2011, 480 (7375): 118-122.

8 Gao X, Wang H, Yang JJ， et al. Pyruvate kinase M2 regulates gene transcription by acting as a protein kinase[J]. Mol Cell, 2012, 45 (5): 598-609.

9 Yang W, Xia Y, Hawke D, et al. PKM2 phosphorylates histone H3 and promotes gene transcription and tumorigenesis[J]. Cell, 2012, 150 (4): 685-696.

10 Chaneton B, Hillmann P, Zheng L, et al. Serine is a natural ligand and allosteric activator of pyruvate kinase M2[J]. Nature, 2012, 491 (7424): 458-462.

11 Keller KE, Tan IS, Lee YS. SAICAR stimulates pyruvate kinase isoform M2 and promotes cancer cell survival in glucose-limited conditions[J]. Science, 2012, 338 (6110): 1069-1072.