尹美珍，游佳清，何圣杰，王 杰，羅 婷，張正懸

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

β-磷酸三鈣對大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化

尹美珍，游佳清，何圣杰，王 杰，羅 婷，張正懸

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

為了研究組織工程骨的種子細(xì)胞和β-磷酸三鈣的骨誘導(dǎo)性，全骨髓法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)，倒置顯微鏡下觀察顯示BMSCS大量增殖，能被β-磷酸三鈣誘導(dǎo)成骨分化，并受BMSCS接種密度的影響。在成骨分化過程中BMSCS表現(xiàn)為成骨細(xì)胞的形態(tài)和集落樣生長行為，對硝基苯磷酸鹽法和茜素紅染色方法檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及礦化結(jié)節(jié)形成，結(jié)果顯示細(xì)胞分泌的堿性磷酸酶活性明顯強(qiáng)于對照組，茜素紅染色呈現(xiàn)紅色結(jié)節(jié)。因此，BMSCS可作為骨缺損修復(fù)治療的種子細(xì)胞，在適宜的接種密度下β-磷酸三鈣能誘導(dǎo)其成骨分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨細(xì)胞；誘導(dǎo)分化；β-磷酸三鈣

0 引言

成骨細(xì)胞的來源譜系有骨髓克隆形成單位、骨祖細(xì)胞和前成骨細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)存在于骨髓，具有旺盛的增殖能力和很強(qiáng)的多向分化潛能。聯(lián)合使用地塞米松、β-磷酸甘油和維生素C能誘導(dǎo)BMSCS成骨分化[1-2]，在一定外界環(huán)境條件下BMSCS還能實(shí)現(xiàn)跨系統(tǒng)分化[3]。BMSCS在誘導(dǎo)條件下，具有成骨細(xì)胞相似的形態(tài)和生長特點(diǎn)，能分泌ALP，啟動礦化[4]。近年來，有研究者通過中藥有效成分探索其對BMSCS的成骨分化[5-8]，可通過誘導(dǎo)堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素的表達(dá)和鈣化結(jié)節(jié)形成促進(jìn)BMSCS的成骨分化。但是，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)在骨疾病及意外骨缺損的治療上，需要采取手術(shù)治療來修復(fù)骨組織。傳統(tǒng)的移植方式有自體骨移植和異體骨移植，由于自體骨移植的來源有限而且對供骨部分有損傷，異體骨移植因免疫排斥反應(yīng)等問題，都限制了臨床的應(yīng)用。現(xiàn)在的研究越來越多應(yīng)用人工骨材料來修復(fù)骨缺損，尤其是研究組織工程骨，因而選擇生物相容性好的材料以及種子細(xì)胞是最首要的環(huán)節(jié)。本文選擇從來源豐富且采集方便的骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)作為種子細(xì)胞，研究生物相容性好的β-磷酸三鈣對BMSCS的定向誘導(dǎo)成骨分化，為構(gòu)建理想的組織工程骨提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1動物和主要試劑

6周齡SD大鼠，120～150g，購自湖北省疾控中心；DMEM/F12培養(yǎng)液購自Gibco 公司；新生胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司；地塞米松和β-甘油磷酸鈉購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；β-磷酸三鈣由武漢理工大學(xué)生物材料與工程研究中心合成。

β-磷酸三鈣浸提液的制作：將β-磷酸三鈣粉末按1g∶10mL浸入含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中96 h，吸出浸提液，無菌封存，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離和純化

用全骨髓法分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞。將分離提取的全骨髓細(xì)胞用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d后換液，以去除懸浮的雜細(xì)胞，再放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d換液1次，重復(fù)數(shù)次。待細(xì)胞長滿瓶底80%以上時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，骨髓中一些不能增殖的細(xì)胞由于傳代而死亡，因此可去除大量的雜細(xì)胞，BMSCS得以純化。

1.3細(xì)胞密度對誘導(dǎo)成骨的影響

取生長良好的第4代BMSCS用胰蛋白酶消化后，以2×104/mL 、1×105/mL、2×105/mL密度接種于無菌6孔板中。每個接種密度的細(xì)胞均設(shè)空白對照組、磷酸三鈣誘導(dǎo)組、陽性誘導(dǎo)組，每組3個復(fù)孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞換相應(yīng)的培養(yǎng)液培養(yǎng)?？瞻讓φ战M換DMEM/F12完全培養(yǎng)液，陽性誘導(dǎo)組換含地塞米松(10-8mol/L)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/L)以及維生素C(50μg/mL)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液，磷酸三鈣誘導(dǎo)組換β-磷酸三鈣浸提液。以后每3～4 d換液1次，并逐日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度對誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成骨的影響。

1.4誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取生長良好的BMSCS，以1×105/mL密度接種于置有無菌蓋玻片的6孔板中，分組以及處理細(xì)胞的方法同上。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成骨的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.5堿性磷酸酶的測定

倒置顯微鏡觀察上述各組細(xì)胞，待6孔板內(nèi)有細(xì)胞出現(xiàn)明顯的集落樣生長時，收集各組細(xì)胞反復(fù)凍融液樣本，采用對硝基苯磷酸二鈉鹽比色法檢測堿性磷酸酶活性，按照試劑盒說明操作。

1.6礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色

上述各組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3周左右，磷酸三鈣誘導(dǎo)組和陽性誘導(dǎo)組均出現(xiàn)肉眼所見的白色結(jié)節(jié)，在倒置顯微鏡下呈圓形或橢圓形的結(jié)節(jié)。取各組細(xì)胞爬片，用PBS沖洗3次，95%的乙醇固定10min。去離子水沖洗后，入0.1%茜素紅染色30min。去離子水沖洗，晾干，封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)的計量數(shù)據(jù)使用SPSS10.0for Windows統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計分析用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1不同細(xì)胞密度對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

細(xì)胞接種密度為2×104/mL時，細(xì)胞稀疏，細(xì)胞無明顯增殖現(xiàn)象，并在培養(yǎng)過程中逐漸老化；細(xì)胞接種密度為1×105/mL時，細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯，經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)，磷酸三鈣誘導(dǎo)組和陽性誘導(dǎo)組的細(xì)胞表現(xiàn)出集落樣生長，并且在大約3周左右，形成了散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)，而空白對照組細(xì)胞無明顯的結(jié)節(jié)出現(xiàn)；細(xì)胞接種密度為2×105/mL時，細(xì)胞較密集，且增殖較快，各組細(xì)胞均勻長滿整個培養(yǎng)板底，連續(xù)培養(yǎng)仍未見細(xì)胞結(jié)節(jié)。由此可見，細(xì)胞接種密度對BMSCS的成骨分化有明顯的影響。

2.2間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的形態(tài)學(xué)變化

細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，細(xì)胞多為三角形和多角形，細(xì)胞之間通過伸出突起連接,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài) (100倍)如圖1所示。細(xì)胞培養(yǎng)8 d后，陽性誘導(dǎo)組和磷酸三鈣誘導(dǎo)組的細(xì)胞均呈集落樣生長，細(xì)胞形態(tài)多變?yōu)樗笮?。隨著培養(yǎng)時間的延長，2個誘導(dǎo)組集落內(nèi)的細(xì)胞高度密集，細(xì)胞形態(tài)逐漸模糊不清，由于細(xì)胞不斷分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而被埋入其中，最終形成圓形或橢圓形結(jié)節(jié)，細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成(100倍)如圖2所示。而空白對照組細(xì)胞長滿瓶底，沒有明顯的成骨分化的形態(tài)學(xué)變化。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài) (100倍)

圖2 細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成(100倍)

2.3間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化后分泌堿性磷酸酶

BMSCS誘導(dǎo)后分泌的堿性磷酸酶活性測定結(jié)果如表1所示。由表1可知，陽性誘導(dǎo)組和磷酸三鈣誘導(dǎo)組分別與空白對照組比較，2個誘導(dǎo)組細(xì)胞反復(fù)凍融液中堿性磷酸酶活性均明顯增加(P<0.05)，說明β-磷酸三鈣能促進(jìn)BMSCS堿性磷酸酶的表達(dá)，與聯(lián)合誘導(dǎo)劑無明顯差別。

表1 BMSCS誘導(dǎo)后分泌的堿性磷酸酶活性測定

注：與空白對照組比較*P<0.05。

2.4礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色

光學(xué)顯微鏡下觀察陽性誘導(dǎo)組和磷酸三鈣誘導(dǎo)組可見的細(xì)胞結(jié)節(jié)，用茜素紅染色呈現(xiàn)紅色，說明形成的細(xì)胞結(jié)節(jié)為鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅染色細(xì)胞結(jié)節(jié)(40倍)如圖3所示。

圖3 茜素紅染色細(xì)胞結(jié)節(jié)(40倍)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化能力，在不同條件下可以分化為所有中胚層來源的組織，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[9]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從增殖、分化為成骨細(xì)胞，并埋于細(xì)胞外基質(zhì)，變?yōu)楣羌?xì)胞，經(jīng)歷了一系列的分化過程。在體外環(huán)境下，BMSCS在向成骨細(xì)胞分化的過程中大致經(jīng)歷以下4個過程：

1)細(xì)胞增殖期。BMSCS大量增殖，并有細(xì)胞形態(tài)由三角形或多邊形變成梭形。

2)細(xì)胞聚集期。細(xì)胞由原來單層細(xì)胞逐步向多層細(xì)胞生長，并且有一部分細(xì)胞開始合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白I型膠原、纖維黏連蛋白。

3)鈣化結(jié)節(jié)形成早期。隨著細(xì)胞的不斷聚集生長，細(xì)胞分泌堿性磷酸酶，合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白將細(xì)胞包埋，堿性磷酸酶被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志[10-11]。

4)鈣化結(jié)節(jié)形成晚期。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的不斷合成和分泌，鈣鹽沉積，形成了礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色。本實(shí)驗(yàn)β-磷酸三鈣與BMSCS作用后，細(xì)胞形態(tài)的變化、生長增殖的行為、堿性磷酸酶的分泌，以及茜素紅染色呈紅色的鈣化結(jié)節(jié)的形成符合BMSCs成骨分化的過程。堿性磷酸酶的含量測定以及鈣化結(jié)節(jié)形成的時間表明β-磷酸三鈣單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCS的成骨分化與地塞米松、β-甘油磷酸鈉以及維生素C聯(lián)合誘導(dǎo)無明顯差別。

4 結(jié)論

β-磷酸三鈣可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，分化后的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和生物學(xué)行為。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化經(jīng)歷：①間充質(zhì)干細(xì)胞大量增殖；②細(xì)胞生長聚集，并分化為成骨細(xì)胞；③細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)以及堿性磷酸酶；④鈣鹽沉積，形成鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞成熟為骨細(xì)胞。β-磷酸三鈣具有很好的誘導(dǎo)BMSCS分化成骨的能力，BMSCS可作為組織工程骨的種子細(xì)胞。

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(責(zé)任編輯吳鴻霞)

Effects of β-tricalcium Phosphate on Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rat

YinMeizhen,YouJiaqing,HeShengjie,WangJie,LuoTing,ZhangZhengxuan

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective:to study seed cells and osteoinduction ability of β-glycerol phosphate for tissue engineering of bone.Method:bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCS) in rat were isolated and cultured with the method of whole bone marrow adherent.Results:inverted microscopy revealed that BMSCScould be mass cultured and be differentiated by β-tricalcium phosphate into osteoblast,but cell seeding density had some effect on induction of differentiation.In the course of osteogenic differentiation,BMSCSshowed a morphology of osteoblasts and biological behavior of colony growth.Nitrophenyl phosphate disodium salt assay and alizarin red staining method was used to determine alkaline phosphatase (ALP) activity and mineral node.The results showed that compared with those of the control group,ALP activity significantly enhanced and Alizarin red staining showed red nodules.Conclusion:BMSCScan be used as seed cells to be differentiated by β-tricalcium phosphate for bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cells;osteoblasts;induced differentiation;β-tricalcium phosphate

2014-04-02

湖北理工學(xué)院2013年實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目。

尹美珍(1969— )，女，副教授，博士，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。

10.3969/j.issn.2095-4565.2014.04.013

R329.2+8

A

2095-4565(2014)04-0051-04