孫 芳， 何振宇

(武漢市疾病預防控制中心， 武漢 430022)

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Hg2+和Cu2+與量子點-酸性磷酸酶體系的相互作用效應研究

孫 芳， 何振宇*

(武漢市疾病預防控制中心， 武漢 430022)

通過測定不同濃度Hg2+和Cu2+與酸性磷酸酶(APase)及量子點標記酸性磷酸酶(QD-APase)體系在不同溫度下發(fā)生相互作用后的熒光變化，計算熱力學常數(shù)，檢測Hg2+和Cu2+對APase及QD-APase活性等手段，研究了Hg2+和Cu2+與APase及QD-APase之間的相互作用效應.結(jié)果表明：Hg2+、Cu2+均能對APase及QD-APase的構(gòu)象與活性產(chǎn)生影響，但首先是通過對APase和QD-APase的結(jié)構(gòu)造成影響，進而才會對其活性產(chǎn)生抑制效應，且Hg2+對APase和QD-APase的構(gòu)象及活性的影響與約10倍劑量的Cu2+相當.Hg2+、Cu2+與QD-APase體系發(fā)生結(jié)合反應的能力強于與APase的結(jié)合，前者的結(jié)合反應是由焓熵共同驅(qū)動，而后者的結(jié)合主要是由熵驅(qū)動.根據(jù)研究結(jié)果可以設計出熒光性能優(yōu)異且具有生物活性的酶探針，在生物標記及熒光分析法檢測重金屬離子對酶的作用效應方面具有良好的應用前景.

CdTe量子點； 酸性磷酸酶； 汞； 銅； 相互作用

酸性磷酸酶(APase)廣泛存在于從低等生物到高等動植物的組織、體液中，是保證生物磷代謝正常進行的重要酶類.金屬離子能夠參與多種生物化學反應，在轉(zhuǎn)運蛋白的作用下廣泛地分布于各細胞組織中，其中很多金屬還充當著各種酶的活性中心，在生命過程中也起著舉足輕重的作用.熒光光譜法是研究金屬離子與酶類相互作用的重要手段，但是由于酶類自發(fā)熒光較弱，使其應用受到了限制.量子點(Quantum dots，QDs)作為一種新型的熒光材料，具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、可忽略的光漂白等優(yōu)越的熒光特性[1].當其與生物大分子結(jié)合后，可以顯著提高生物大分子的熒光，因此量子點在生物學的研究中顯示出了極大的應用前景和開發(fā)價值.

本文以對人體有害的元素汞和必需微量元素銅為金屬離子的代表，利用熒光光譜法探討了酸性磷酸酶及CdTe量子點標記的酸性磷酸酶體系(QD-APase)與Hg2+和Cu2+的作用效應，建立了其與Hg2+和Cu2+的劑量-效應關系，并進一步研究了Hg2+和Cu2+對APase和QD-APase活性的影響，對于分析酶類與重金屬污染物發(fā)生的相互作用具有重要意義.

1材料與方法

1.1儀器與試劑

CARY Elipse型熒光光譜儀(美國瓦里安)；純水儀(美國Millipore)；PHS-3C型pH計(中國杭州)；電控多用恒溫水箱(中國江蘇TL-4200型)；TL-4200型電控多用恒溫水箱.

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase from potato 簡稱APase，分子量69 000，)、三羥甲基氨基甲烷(Tirs，>99.8%)、對硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)購于SIGMA公司，對硝基苯酚(p-Nitrophenol，>99.5%)購于國藥集團上?；瘜W試劑有限公司，汞、銅標準溶液(100 mg/L)購于國家標準物質(zhì)中心，CdTe量子點自制.實驗中所用水均為電阻率大于 18 MΩ·cm 的高純水.

1.2CdTe量子點及QD-APase復合物的制備

按照文獻[2]方法制備CdTe量子點，簡要制備過程如下：向50 mL燒杯中加入25.25 mL純水，置于磁力攪拌器上，并通入氮氣脫氧10 min，邊攪拌邊加入5 mL 0.01 mol/L CdCl2溶液和6 mL 0.01 mol/L巰基乙酸溶液，混合均勻后用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)至pH10.6，再向該溶液中加入3.75 mL 新制備的0.005 mol/L KHTe溶液后，轉(zhuǎn)入100 mL的聚四氟乙烯微波消解罐，并置于可控溫的微波加熱系統(tǒng)，在1 000 W和100℃下，加熱15 min.待溶液冷卻至室溫，即可得到尺度分布較均勻的CdTe 量子點溶膠.將CdTe量子點與APase混合，混合后濃度分別為2.5×10-4mol/L和5×10-6mol/L，置于溫度為32℃電控多用恒溫水箱中，反應35 min即可得到穩(wěn)定的QD-APase復合物.

1.3Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase的相互作用

取5×10-6mol/L的Apase及QD-APase溶液1 mL于多個10 mL比色管中，向Apase中分別加入0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0×10-4mol/L的Hg2+及0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0×10-4mol/L的Cu2+，向QD-APase中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5×10-6mol/L的Hg2+及0、1.0、2.5、5.0、7.5、10×10-6mol/L的Cu2+，用pH5.0、0.01 mol/L Trsi-HCl緩沖液定容至10 mL，將配制完后的比色管分別放置在27℃、37℃、42℃恒溫水浴鍋中反應35 min，在恒溫熒光光譜儀中測定其熒光.激發(fā)波長350 nm、掃描范圍400～700 nm、掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度為5 nm.

1.4酶活性測定

分別取5×10-6mol/L的Apase及QD-APase溶液1 mL于多個10 mL比色管中，向Apase中分別加入0～2.0×10-4mol/L的Hg2+及0～40×10-4mol/L的Cu2+，向QD-APase中分別加入0～5×10-5mol/L的Hg2+及0～40×10-5mol/L的Cu2+， 37℃保溫10 min.加入含有6 mmol/L對硝基苯磷酸二鈉鹽的pH5.0的0.01 mol/LTrsi-HCl緩沖液5 mL.混勻后置于37℃水浴1 h，立即加入1 mol/L的NaOH溶液1 mL終止酶反應，用純水定容至10 mL.稍微靜置后用分光光度計于405 nm波長下測定對硝基苯酚濃度.酶活性用μg對硝基苯酚/1 h表示.

2結(jié)果與討論

2.1Hg2+、Cu2+對APase和QD-APase的熒光猝滅效應

Hg2+和Cu2+兩種金屬離子對APase及QD-AP-ase的熒光強度的影響結(jié)果如圖1、圖2所示.

注：[Hg2+] 從 a到f為0， 0.25， 0.5， 1.0， 2.5 and 5.0 ×10-4 mol/L；[Cu2+] 從a到 f為0， 0.25， 0.50， 1.0， 2.5 and 5.0×10-3 mol/L圖1 Hg2+和Cu2+對APase熒光光譜的影響Fig.1 Effect of Fluorescence Spectra of APase on different concentration Hg2+ and Cu2+

由圖1可知，隨著溶液中Hg2+和Cu2+離子濃度的逐漸增加，APase的自身熒光強度隨著離子濃度的上升而下降.根據(jù)Hg2+和Cu2+濃度與APase熒光猝滅的效果還可以看出，Hg2+對APase熒光的影響與10倍量的Cu2+的作用效果相當，說明Hg2+對APase構(gòu)象的影響更為明顯.

由圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著溶液中Hg2+和Cu2+離子濃度的增加， QD-APase體系中QD的熒光強度發(fā)生了有規(guī)律的猝滅現(xiàn)象.Hg2+與QD-APase體系發(fā)生相互作用后QD的熒光峰位置基本沒有發(fā)生變化，表明Hg2+對QD-APase的熒光猝滅是以電子遷移為主.Cu2+與QD-APase發(fā)生相互作用后QD的熒光峰位置發(fā)生了紅移，表明Cu2+可能與量子點核上的非輻射電子/空洞結(jié)合，因此反應之后QD粒徑變大，導致熒光峰位置發(fā)生紅移.在圖2的濃度條件下，考查了Hg2+和Cu2+對QD-APase體系中APase熒光光譜的影響.結(jié)果顯示，在Hg2+和Cu2+濃度較低的情況下，它們對APase的熒光未產(chǎn)生明顯的影響，表明該濃度條件下Hg2+和Cu2+對APase的構(gòu)象并未發(fā)生明顯改變.

注：[Hg2+]從A 到F為0， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5×10-6 mol/L ;[Cu2+]從A 到F為0，1.0， 2.5， 5.0， 7.5， 10×10-6 mol/L圖2 Hg2+和Cu2+對QD-APase熒光光譜的影響Fig.2 Effect of fluorescence spectra of QD-APase on different concentration Hg2+ and Cu2+

2.2Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase的相互作用效應

表1 不同溫度下Hg2+和Cu2+對APase 及QD-Apase的猝滅速率常數(shù)和結(jié)合常數(shù)Tab.1 Quenching rate constants and binding constants of Hg2+ and Cu2+ to APase and QD-APase at different temperatures

動態(tài)猝滅過程中，溫度升高有利于熒光體和猝滅劑分子間的有效碰撞，從而使猝滅速率加快，Kq或Ks增大(斜率增大).而靜態(tài)猝滅是由于熒光物質(zhì)和猝滅劑之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，二者形成了復合物而引起，故溫度升高將使復合物穩(wěn)定性下降，Ka值減小.因此，高溫有利于動態(tài)猝滅，低溫有利于靜態(tài)猝滅.由表1可知，Hg2+和Cu2+對APase熒光猝滅的KS、Kq、Ka均隨著溫度的升高而增大，因此認為Hg2+和Cu2+引起APase熒光猝滅同時存在靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種機理，可以推測Hg2+和Cu2+與APase至少有兩類結(jié)合位點.由表1還可以看出，Hg2+和Cu2+對QD-APase體系的熒光猝滅隨著溫度升高，Kq、Ks及Ka均減小，說明Hg2+和Cu2+對QD-APase的熒光猝滅均是靜態(tài)猝滅.

2.3Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase結(jié)合反應的熱力學常數(shù)

考慮到Ka與溫度有關，可以利用熱力學常數(shù)進一步研究Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase的結(jié)合模式.當溫度變化不大時，可以認為反應焓變值ΔH和熵變ΔS沒有明顯的變化，通過Van’t Hoff方程可以計算得到反應過程的標準焓變和熵變，進而計算出不同溫度下反應的Gibbs自由能(ΔG)的大小[4]，計算結(jié)果見表2.

表2 Hg2+和Cu2+與APase及QD-Apase的

結(jié)合反應熱力學參數(shù)

Tab.2 Thermodynamic parameters of the interaction

between Hg2+，Cu2+ and APase， QD-APase

由表2可以看出，Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase體系發(fā)生相互作用的ΔG均小于0，說明經(jīng)過Hg2+和Cu2+與二者結(jié)合的反應均能自發(fā)進行. Hg2+和Cu2+與APase結(jié)合的ΔH均為正值，表明這是一個吸熱過程，溫度升高有利于反應的進行；Hg2+和Cu2+與QD-APase體系結(jié)合的ΔH均為負值，表明Hg2+和Cu2+與QD-APase體系的反應是放熱過程，溫度降低有利于反應的進行.Hg2+、Cu2+與APase和QD-APase體系發(fā)生相互作用的ΔS均為正值，根據(jù)Ross等[5]結(jié)合大量實驗總結(jié)的生物大分子與小分子之間主要作用力與熱力學參數(shù)之間的關系，表明Hg2+和Cu2+與APase主要是通過典型的疏水作用力結(jié)合(ΔH>0，ΔS>0)，而Hg2+和Cu2+與QD-APase體系主要是依靠靜電引力結(jié)合(ΔH<0，ΔS>0).進一步對Hg2+和Cu2+與APase和QD-APase體系結(jié)合反應的的熱力學常數(shù)進行比較，可知Hg2+和Cu2+與QD-APase體系發(fā)生結(jié)合反應的能力強于Hg2+和Cu2+與APase的結(jié)合，前者的結(jié)合反應是由焓熵共同驅(qū)動，而后者的結(jié)合主要是由熵驅(qū)動.

2.4Hg2+、Cu2+對APase和QD-APase活性的影響

金屬離子是影響酶活性的一個重要因素.金屬離子可以與酶分子中的活性部位結(jié)合，形成較穩(wěn)定的絡合物，產(chǎn)生與底物的競爭性抑制，從而對酶的活性造成影響.將Apase和QD-APase與不同濃度的Hg2+和Cu2+混合后于37℃恒溫10 min，然后測定酶的活力，結(jié)果如圖3、圖4所示.

圖3 Hg2+和Cu2+對APase活性的影響Fig.3 The effect of Hg2+ and Cu2+ on the activities of APase

由圖3可知，APase活性隨金屬離子濃度的增加呈現(xiàn)先激活后抑制的過程.Hg2+對APase活性的影響非常明顯，當濃度小于0.04 mmol/L，Hg2+對APase的活性表現(xiàn)為激活的狀態(tài)，而當濃度大于0.04 mmol/L時， Hg2+對酶活性發(fā)生了快速的抑制作用.Cu2+濃度小于0.1 mmol/L時對APase活性表現(xiàn)為激活作用，當濃度大于0.1 mmol/L時，對APase活性逐漸起到抑制作用.

圖4 Hg2+和Cu2+對QD-APase活性的影響Fig.4 The effect of Hg2+ and Cu2+ on the activities of QD-APase

由圖4可知，當Hg2+濃度小于0.5×10-5mol/L、Cu2+濃度小于0.25×10-4mol/L時，均未對CdTe量子點標記APase體系的活性產(chǎn)生影響；當Hg2+濃度大于0.5×10-5mol/L、Cu2+濃度大于0.25×10-4mol/L后，QD-APase體系的活性隨金屬離子濃度的增加而逐漸降低.通過與圖3的比較發(fā)現(xiàn)，當Apase與QD結(jié)合后，Hg2+和Cu2+與之反應將不再對APase的活性產(chǎn)生激活作用，同時Hg2+和Cu2+對QD-APase體系活性產(chǎn)生抑制作用的濃度(0.5×10-5mol/L，0.25×10-4mol/L)也較APase單獨存在情況下(0.4×10-4mol/L，0.1×10-3mol/L)降低了一個數(shù)量級左右，表明重金屬離子對QD-APase活性抑制效果較APase明顯增強.發(fā)生上述現(xiàn)象的原因是由于QD與APase形成復合物后，占據(jù)了APase的部分活性中心，導致APase活性的鈍化.當再有金屬離子加入后，已經(jīng)不能再促進APase活性中心與底物間的配位結(jié)合，因此金屬離子對APase的激活作用不再發(fā)生.隨著金屬離子濃度的增加，能夠與APase分子上包埋較深的某些側(cè)鏈基團螯合，使APase活性中心緊縮，從而降低其柔性，不利于酶與底物的結(jié)合與催化，因此金屬離子在濃度相對較低的情況下直接對酶的活性產(chǎn)生了抑制，且Hg2+對CdTe量子點標記APase體系的活性抑制作用較Cu2+更為明顯.

3結(jié)論

本文以熒光光譜法為基礎，通過研究Hg2+、Cu2+對APase和QD-APase的熒光猝滅效應、相互作用效應、結(jié)合反應的熱力學常數(shù)及酶活性的影響，表明Hg2+和Cu2+引起APase熒光猝滅同時存在靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種機制，而對QD-APase的熒光猝滅均是靜態(tài)猝滅.結(jié)果還表明，隨著Hg2+和Cu2+濃度的逐漸增加，均會對APase及QD-APase的構(gòu)象與活性產(chǎn)生影響，但是在Hg2+和Cu2+濃度較低的情況下首先能對APase和QD-APase的結(jié)構(gòu)造成影響，隨著濃度增加，進而才會對APase及QD-APase的活性產(chǎn)生抑制效應，且Hg2+對APase和QD-APase的構(gòu)象及活性的影響與約10倍劑量的Cu2+相當，說明Hg2+的生物毒性大大高于Cu2+.Hg2+、Cu2+與QD-APase體系發(fā)生結(jié)合反應的能力強于與APase的結(jié)合，前者的結(jié)合反應是由焓熵共同驅(qū)動，而后者的結(jié)合主要是由熵驅(qū)動.根據(jù)上述研究結(jié)果可以設計出熒光性能優(yōu)異且具有生物活性的量子點-酶探針，在生物標記及熒光分析法檢測重金屬離子對酶的作用效應方面具有良好的應用前景.

[1] Yong K T. Quantum dots for biophotonics[J]. Theranostics, 2012， 2:629-630.

[2] 何振宇， 朱洪浩， 周培疆. 微波加熱法制備羧甲基殼聚糖-CdTe量子點及其在細胞標記中的應用[J].公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學, 2012， 23(1):4-7.

[3] 吳春惠， 葉紅德， 吳德洪, 等. 熒光光譜法研究新型碳硼烷金屬有機衍生物與牛血清白蛋白的相互作用[J].光譜學與光譜分析, 2013， 33(1):120-125

[4] Xiao Q， Huang S， Qi Z D.Conformation，thermodynamics and stoichiomet of HSA adsorbed to colloidal CdSe/ZnS quantum dots[J].Biochimica et Biophysica Acta,2009， 1784: 1020-1027．

[5] Ross D P， Sabramanian S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability [J]. Biochemistry， 1981， 20(11): 3096-3102.

Study of the interaction between Hg2+， Cu2+and quantum dots-labeled acidic phosphatase

SUN Fang， HE Zhenyu

(Wuhan Centers for Disease Prevention and Control， Wuhan 430022)

In this paper， the fluorescence of the system was measured under different temperatures with various concentrations of Hg2+and Cu2+interacting with Apase and QD-APase. Thermodynamic constants of the Cu2+and Hg2+binding to APase and QD-APase were calculated and the effect of metal ions on the enzymatic activity of APase with or without QD labeling was determined. By these means， the interaction between Hg2+， Cu2+， and acidic phosphatase with or without QD labeling is studied. The results showed that both Cu2+and Hg2+showed an influence on the configuration of the APase with or without QD-labeling before the enzymatic activity of the enzymatic system was affected. Dose effect of Hg2+on the system was 10 times higher than that of Cu2+. The binding affinity of the metal ions with QD-APase complex was much higher than with APase alone. The former binding reaction was powered by entropy and enthalpy change whereas the latter was powered by entropy change alone. Enzymatic probe of excellent fluorescent features and biological activities can be designed based on the result of the study， which was very promising in its application in bio-labeling and detection and measurement of the effect of heavy metal ions on enzymes by fluorescence activity．

CdTe quantum dots; acidic phosphatase; Hg2+; Cu2+; interaction

2014-03-12.

國家863計劃(2007AA06Z418);武漢市衛(wèi)生局公共衛(wèi)生科研項目(WG08A02).

1000-1190(2014)04-0559-06

O657;Q55

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: hosan9174@163.com.