余曉東， 邱燕子， 黃宗華， 陳 玉， 宋發(fā)軍*

(1.中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室， 武漢 430074；

?

羥丙基-β-環(huán)糊精與青霉素酶的相互作用

余曉東1， 邱燕子1， 黃宗華1， 陳 玉2， 宋發(fā)軍1*

(1.中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室， 武漢 430074；

2.中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

應(yīng)用紫外分光光度法、熒光分析法研究了羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)包合青霉素酶后酶活力的變化；熒光分析法檢測不同溫度下HP-β-CD對青霉素酶內(nèi)在熒光的影響；將HP-β-CD與青霉素酶進(jìn)行分子對接，分析青霉素酶與HP-β-CD相互作用的位點及作用方式；測定青霉素酶被HP-β-CD包合后對青霉素鈉的分解速率.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HP-β-CD作用后的青霉素酶復(fù)合物的活力提高了2.12倍.熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)：HP-β-CD對酶蛋白熒光有增敏作用，HP-β-CD包合青霉素酶的包合比為1∶1，包合反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行.同步熒光結(jié)果顯示：HP-β-CD與青霉素酶復(fù)合物同步熒光比青霉素酶強(qiáng)，酶蛋白熒光主要源于酪氨酸(Tyr)殘基.分子對接實驗結(jié)果顯示：HP-β-CD與青霉素酶之間共形成了3對氫鍵，VAL39、ASN180和ASP183參與了氫鍵的形成.

羥丙基-β-環(huán)糊精； 青霉素酶； 分子對接

β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin，簡稱β-CD)是直鏈淀粉由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的環(huán)狀低聚糖，含有7個D-吡喃葡萄糖單元.β-CD的外緣親水而內(nèi)腔疏水，它能夠象酶一樣提供一個疏水的結(jié)合部位，作為主體包絡(luò)各種適當(dāng)?shù)目腕w，如有機(jī)分子、無機(jī)離子以及氣體分子等.這種選擇性的包絡(luò)作用即通常所說的分子識別，其結(jié)果是形成主客體包絡(luò)物(Host-Guest Complex).β-CD是迄今所發(fā)現(xiàn)的類似于酶的理想宿主分子，并且其本身就有酶模型的特性.因此，在催化、分離、食品以及藥物等[1-3]領(lǐng)域中，β-CD受到了極大的重視和廣泛應(yīng)用.

羥丙基-β-環(huán)糊精( HP-β-CD) 是由β-CD和環(huán)氧丙烷在堿性條件下發(fā)生縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，由于其具有內(nèi)疏水外親水的特殊空腔結(jié)構(gòu)及水溶性強(qiáng)的特點[4]，已被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[5].

青霉素酶 (EC 3.5.2.6) 是催化水解青霉素β-內(nèi)酰胺環(huán)， 使青霉素變成無抗菌活性的青霉素酮酸的一類β-內(nèi)酰胺酶[6].上個世紀(jì)40年代青霉素還未廣泛應(yīng)用于臨床時， Abraham 等就從耐青霉素的E.coli K12中發(fā)現(xiàn)了青霉素酶[7].一方面細(xì)菌產(chǎn)生青霉素酶導(dǎo)致耐藥性， 但另一方面，利用青霉素酶具有水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點， 可用于抗生素藥品質(zhì)量檢驗和新抗菌藥物篩選.青霉素酶最具前景的用途是對牛奶中的青霉素殘留的快速定量測定、對青霉素含量超標(biāo)的牛乳除去青霉素的處理.國外在20世紀(jì)80年代中期就開展了青霉素酶固定化、處理青霉素超標(biāo)牛乳的研究.由于青霉素酶具有價格低廉和靈敏度高等優(yōu)點，可在酶聯(lián)免疫分析(ELISA)中替代傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶.我國對青霉素酶的研究起步較晚.1999 年，中國藥品生物制品檢定所分離出1株能產(chǎn)生青霉素酶的蠟狀芽孢桿菌CMCC(B)63301， 并對該酶的發(fā)酵方法、水解酶譜和保存穩(wěn)定性等方面進(jìn)行了研究[8].

本文用紫外及熒光分析法研究了青霉素酶和HP-β-CD的相互作用，測定了酶促反應(yīng)速率的變化；通過熒光光譜法研究了不同溫度下青霉素酶和HP-β-CD的相互作用，測定了青霉素酶與HP-β-CD作用前后內(nèi)在熒光的變化；用分子對接方法和計算機(jī)輔助手段研究了青霉素酶與HP-β-CD的作用方式、作用位點及主要作用力.對青霉素酶HP-β-CD復(fù)合物的研究，以期提高青霉素酶的活力，增加青霉素酶檢測青霉素殘留的靈敏度，從而使青霉素酶的應(yīng)用更加廣闊.

1實驗方法

1.1酶活性的測定

將青霉素鈉溶液在紫外分光光度計中進(jìn)行光譜掃描，確定青霉素鈉的吸收峰位置.以pH=7.0磷酸緩沖液為參比，將青霉素鈉溶液放置于37℃恒溫水浴鍋中保溫5 min，加入預(yù)先保溫的HP-β-CD溶液和青霉素酶液的混合液，于青霉素鈉最大波長記錄反應(yīng)過程.

表1 HP-β-CD與青霉素酶活力測定樣品配制Tab.1 The sample preparation of HP-β-CD and penicillinase mL

按表1操作，取4只離心管，分別將不同濃度的HP-β-CD加入離心管中，再往各管中加入20 μL青霉素酶溶液，混勻，于37℃恒溫水浴1 h，形成穩(wěn)定包合物后，再加入底物青霉素鈉溶液，每隔5 s記錄吸收值直至反應(yīng)完全.青霉素酶濃度為1.2×106U/L， HP-β-CD濃度為1×10-2mol/L，青霉素鈉濃度為1×10-5mol/L.

1.2熒光光譜分析

HP-β-CD濃度為1×10-2mol/L，青霉素酶濃度為1.2×106U/L，均用pH=7.0的磷酸緩沖液溶解，4℃保存?zhèn)溆?

表2 光譜測定樣品配制Tab.2 The sample preparation of spectrometry mL

按表2操作：將各樣品混合溶液混勻，靜置1 h.在激發(fā)波長λex=280 nm處，記錄λex=300～520范圍的熒光發(fā)射光譜.分別設(shè)定Δλ=20 nm和Δλ=80 nm獲得青霉素酶的酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的同步熒光光譜.激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度為10.0 nm， 0.2 mol/L(pH7.2)的Tris-HCl緩沖液為參照.

用熒光光譜法測定不同濃度的HP-β-CD對青霉素酶的內(nèi)在熒光并進(jìn)行表征.根據(jù)Benesi-Hildebrand公式(1)，以1/(F-Fo)對1/[CD]作出雙倒數(shù)圖，再由線性關(guān)系圖得到HP-β-CD與青霉素酶的包合比，計算出結(jié)合常數(shù)K和吉布斯自由能ΔG，其中結(jié)合常數(shù)K值為線性方程中的截距與斜率之比，ΔG=-RTlnK．

(1)

[G]0：青霉素酶的起始濃度;[CD]：HP-β-CD的濃度;ΔF=F-F0，其中F0和F分別為自由青霉素酶及HP-β-CD存在時青霉素酶的熒光強(qiáng)度;k和Q分別為儀器常數(shù)和熒光量子產(chǎn)率.

1.3分子對接

分子對接實驗中所有軟件參數(shù)均使用默認(rèn)值(Studio Visualizer 2.5軟件包).青霉素酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB-ID， 3111)，含有227個氨基酸，僅有一條肽鏈組成；HP-β-CD的三維結(jié)構(gòu)經(jīng)過半經(jīng)驗量化計算(MOPAC)優(yōu)化后用于分子模擬實驗.

2結(jié)果與分析

2.1HP-β-CD對青霉素酶活力的影響

對青霉素鈉樣品進(jìn)行紫外掃描，確定樣品的最大吸收波長值在λ=233 nm處.20 μL青霉素酶催化水解青霉素鈉溶液時間超過6 min之后，吸光度值不再改變，因此確定反應(yīng)所需的時間為6 min.

(A:none HP-β-CD； B:HP-β-CD=0.667×10-7 mol/L； C:HP-β-CD=1.33×10-7 mol/L；D:HP-β-CD=3.33×10-7 mol/L)圖1 HP-β-CD對青霉素酶活力的影響Fig.1 HP-β-CD enhance enzymatic activity of penicillinase表3 酶活力測定線性方程Tab.3 The linear equations of enzymatic activity determination

名稱線性方程相關(guān)系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差A(yù)y=0.7048-0.0787x0.9980.0034By=0.7096-0.1325x0.9990.0019Cy=0.6700-0.1441x0.9990.0034Dy=0.6897-0.1662x0.9990.0046

實驗均在37℃、pH=7.0條件下進(jìn)行，隨著HP-β-CD的濃度增加，青霉素酶的活性增強(qiáng)，酶促反應(yīng)速率增快.由圖1中可以看出：HP-β-CD對青霉素酶的活力有促進(jìn)作用.

由表3可知分別加入不同濃度的HP-β-CD，對青霉素酶活力的影響也不同，當(dāng)HP-β-CD終濃度分別為：0、0.667×10-7mol/L、1.33×10-7mol/L和3.33×10-7mol/L時，青霉素鈉每分鐘的分解反應(yīng)速率變化分別是：0.078 7、0.132 5、0.144 1和0.166 2.HP-β-CD濃度為3.33×10-7mol/L，青霉素鈉的分解反應(yīng)速率為原來的2.12倍.實驗表明，HP-β-CD對青霉素酶進(jìn)行包合后，青霉素酶的酶活性得到提高.

2.2HP-β-CD對青霉素酶酶蛋白熒光的影響

圖2為HP-β-CD與青霉素酶相互作用的熒光光譜，當(dāng)λem=280 nm時，青霉素酶最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在330 nm附近.

Penicillinase:3×104U/L;HP-β-CD:(0～9)×10-6 mol/L圖2 HP-β-CD與青霉素酶相互作用的熒光光譜Fig.2 The fluorescence spectrum of interaction between HP-β-CD and penicillinase

磷酸緩沖液和HP-β-CD無熒光光譜，但HP-β-CD對磷酸緩沖液的溶劑峰有一定的增強(qiáng)作用；因此本實驗選擇Tris-HCl緩沖液為溶劑，以排除溶劑對熒光強(qiáng)度的干擾.由圖2可知隨著HP-β-CD終濃度的升高，青霉素酶的熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，發(fā)射峰藍(lán)移.

The linear equation is:y=71.33+88.41x， r=0.998；y=51.41+84.81x， r=0.999; y=31.65+81.10x，r=0.998， in 293 K，303 K，313 K respectively.圖3 不同溫度下的HP-β-CD與青霉素酶 復(fù)合物的熒光極值的線性關(guān)系圖Fig.3 The linear equations of HP-β-CD- penicillinase complex fluorescence maximum value in differently temperature

由圖3可知：直線的斜率隨溫度升高而下降，即隨著溫度的升高，青霉素酶的熒光強(qiáng)度下降；相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好.當(dāng)溫度為293 K時，HP-β-CD對青霉素酶的熒光增敏作用最明顯.可見，溫度對復(fù)合物的熒光值有一定的影響，溫度較低時，青霉素酶及其復(fù)合物的熒光值較大.

圖4 熒光增加值(ΔF)與HP-β-CD濃度的關(guān)系Fig.4 The relationship of ΔF and HP-β-CD concentration

圖5 不同溫度下的雙倒數(shù)圖Fig.5 The double reciprocal plot in differently temperature表4 不同溫度下的雙倒數(shù)方程、結(jié)合常數(shù)、自由能Tab.4 The double reciprocal plot equations，binding constant and free energy in differently temperature

T/KThelinearequationcoefficientK/M-1ΔG/(kJ·mol-1)293y=-0.0019+0.0218x0.99188.65-1.94303y=-0.0010+0.0176x0.99657.42-1.87313y=-0.0028+0.0283x0.99198.02-2.10

由圖4可以看出：ΔF與HP-β-CD的濃度關(guān)系表現(xiàn)出Langmuir單分子吸附等溫線規(guī)律：ΔF先線性增加，后趨近平衡，推測HP-β-CD與青霉素酶的包結(jié)化學(xué)計量比為1∶1，即HP-β-CD與青霉素酶1∶1包合.根據(jù)公式(1)，以1/(F-Fo)對1/[CD]作圖得到圖5.結(jié)合常數(shù)K等于截距與斜率之比；由ΔG=-RTlnK，計算各溫度下的自由能變化值.圖5和表4中，雙倒數(shù)圖的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好；證明HP-β-CD與青霉素酶包結(jié)物的化學(xué)計量比為1∶1，且與溫度相關(guān).根據(jù)表4可知，當(dāng)溫度分別為293 K、303 K和313 K時，結(jié)合常數(shù)分別為88.65 M-1、57.42 M-1和98.02 M-1，同時其吉布斯自由能(ΔG)分別為-1.94 kJ/mol、-1.87 kJ/mol和-2.10 kJ/mol.當(dāng)計量比為1∶1時，在293 K與313 K的結(jié)合常數(shù)明顯大于303 K；由此可以認(rèn)為在293 K與313 K時，比303 K時更有利于復(fù)合物的形成.包合常數(shù)的差異說明客體對主體的包合能力不同，溫度對復(fù)合物的化學(xué)計量比有極大的相關(guān)性.由于HP-β-CD包結(jié)青霉素酶過程的ΔG均為負(fù)值，表明包合反應(yīng)均能自發(fā)進(jìn)行.總的來講，各溫度下的包合常數(shù)和吉布斯自由能的差值均不明顯.

2.3HP-β-CD對青霉素酶酶蛋白酪氨酸和色氨酸殘基熒光的影響

由Δλ=λem-λex，得到同步熒光譜圖，當(dāng)Δλ=20 nm時，僅顯示青霉素酶酪氨酸殘基的同步熒光光譜特征；當(dāng)Δλ=80 nm時，僅顯示青霉素酶色氨酸殘基的同步熒光光譜特征.

圖6 HP-β-CD與青霉素酶相互作用的同步熒光光譜Fig.6 The synchronous fluorescence spectrum of HP-β-CD-penicillinase complex

圖6中，曲線l是青霉素酶的酪氨酸(Tyr)同步熒光光譜；曲線3是青霉素酶色氨酸(Trp)殘基的同步熒光光譜；曲線2是加入HP-β-CD作用青霉素酶后，酪氨酸(Tyr)的同步熒光光譜；曲線4是加入HP-β-CD作用青霉素酶后，色氨酸(Trp)的同步熒光光譜.酪氨酸(Tyr)在280 nm左右有最大峰，而色氨酸(Trp)在360 nm處出現(xiàn)最大峰.由圖6可以看出，加入HP-β-CD后，酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光均增大，可以看出實驗中青霉素酶的熒光主要源于酪氨酸(Tyr)殘基，且其最大吸收峰藍(lán)移.表明HP-β-CD和青霉素酶發(fā)生了相互作用，且對酪氨酸(Tyr)殘基的影響更為明顯.

2.4HP-β-CD與青霉素酶相互作用的分子對接分析

分子對接研究為HP-β-CD和青霉素酶之間相互作用提供了主體HP-β-CD和青霉素酶氨基酸殘基相互作用的精確信息.根據(jù)分子對接研究可知，HP-β-CD分子作用于青霉素酶分子的表面.

圖7顯示了0.2 nm范圍內(nèi)主要的青霉素酶氨基酸殘基與HP-β-CD之間氫鍵供體和氫鍵受體輪廓圖.從圖7中可以看出，在0.2 nm范圍內(nèi)的氨基酸有：VAL39、TRP59、HIS88、ALA89、ASP90、ASP177、LEU178、GLY179、ASN180、VAL181、ALA182、ASP183和HIS210，總共13個氨基酸.其

圖7 HP-β-CD和青霉素酶(PDB-ID，3111)特異性作用區(qū)域及HP-β-CD 主體0.2 nm范圍內(nèi)標(biāo)記的蛋白殘基及氫鍵作用力Fig.7 The specificity region and amino acid residues and hydrogen bonds of HP-β-CD-penicillinase complex

圖8 在Studio Visualizer 2.5中標(biāo)記HP-β-CD和 青霉素酶(PDB-ID，3111)氫鍵作用的殘基和位點Fig.8 The amino acid residues and sites of hydrogen bond formation were marked with Studio Visualizer 2.5 software

圖9 青霉素酶(PDB-ID，3111)與HP-β-CD相互 作用的特異位點(Studio Visualizer 2.5)Fig.9 The distinctive sites of HP-β-CD- penicillinase complex were marked on this protein surface with Studio Visualizer 2.5 software

中疏水性氨基酸的百分比約占46%，表明疏水作用力是HP-β-CD和青霉素酶的主要相互作用之一.

圖8反映了HP-β-CD和青霉素酶(PDB-ID，3111)之間的相互作用，可能形成了3組氫鍵.參與的氨基酸殘基有VAL39、ASN180和ASP183，其中為VAL39和ASN180是質(zhì)子供體，氫鍵距離分別為0.202 nm 和 0.242 nm；ASP183為質(zhì)子受體，氫鍵距離值為0.208 nm.

為了更好的觀察HP-β-CD和青霉素酶分子之間的相互作用，用Studio Visualizer 2.5軟件處理后得到圖9的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)骨架被描繪成一條緞帶或管狀結(jié)構(gòu)，圓柱狀表示α螺旋，可以看出，HP-β-CD主體0.2 nm范圍內(nèi)僅有α螺旋結(jié)構(gòu)，且ASN180和ASP183在同一段α螺旋上.

3結(jié)論

HP-β-CD作為一種外加試劑與青霉素酶作用，測定作用前后青霉素酶活力的變化，發(fā)現(xiàn)作用后的青霉素酶復(fù)合物酶活力升高.當(dāng)HP-β-CD濃度分別為：0、0.067×10-7mol/L、0.133×10-7mol/L和 3.33×10-7mol/L時，活力分別是：0.078 7、0.132 5、0.144 1和0.166 2.當(dāng)HP-β-CD濃度為3.33×10-7mol/L，青霉素酶復(fù)合物的酶活力為青霉素酶的2.12倍.

測定青霉素酶的固有熒光強(qiáng)度以及青霉素酶與不同濃度HP-β-CD的復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，用Benesi-Hildebrand公式、吉布斯自由能公式計算，得出溫度分別為293 K、303 K和313 K時，結(jié)合常數(shù)分別為88.65 M-1、57.42 M-1和98.02 M-1，吉布斯自由能(ΔG)分別為-1.94 kJ/mol、-1.87 kJ/mol和-2.10 kJ/mol.在293 K與313 K的結(jié)合常數(shù)明顯大于303 K.可以認(rèn)為在293 K與313 K時，比303 K時更有利于復(fù)合物的形成.

雙倒數(shù)作圖得出了HP-β-CD與青霉素酶包合比為1∶1，實驗表明HP-β-CD與青霉素酶包結(jié)過程的ΔG均為負(fù)值，說明包合反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行.

同步熒光結(jié)果顯示酪氨酸(Tyr)殘基和色氨酸(Trp)殘基分別在280 nm和345 nm處出現(xiàn)發(fā)射峰，HP-β-CD-青霉素酶復(fù)合物的同步熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，青霉素酶的熒光主要源于酪氨酸(Tyr)殘基，其最大吸收峰位置藍(lán)移.表明HP-β-CD和青霉素酶的相互作用位點同時接近色氨酸(Trp)殘基和酪氨酸(Tyr)殘基，且HP-β-CD對酪氨酸(Tyr)殘基的影響更為明顯.

分子對接顯示：HP-β-CD與青霉素酶之間共形成了3對氫鍵，其中為VAL39和ASN180是質(zhì)子供體，氫鍵鍵長分別為0.202 nm 和 0.242 nm，ASP183為質(zhì)子受體，氫鍵鍵長為0.208 nm.

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Study on interactions between hydroxypropyl-β-cyclodextrins and penicillinase

YU Xiaodong1， QIU Yanzi1， HUANG Zonghua1， CHEN Yu2， SONG Fajun1

(1. Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China，College of Life Science， South Central University for Nationalities， Wuhan 430074;2.College of Chemistry and Materials Science， South-Central University for Nationalities ，Wuhan 430074)

Uv-vis and fluorescence analysis methods were applied to determine enzyme activity of penicillinase and HP-β-CD-penicillinase complex. Fluorescence analysis was used to study the influence of HP-β-CD on the inner fluorescent of penicillinase at different temperatures. The molecular docking was employed to study the interaction sites and modes between penicillinase and HP-β-CD. By comparing the influences on the hydrolysis rate of penicillin sodium brought by penicillinase and HP-β-CD-penicillinase complex， it could be found that the catalysis rate of HP-β-CD-penicillinase complex increased 2.12 times than penicillinase. The fluorescent spectrometry indicated that HP-β-CD could improve the sensitization of the fluorescence of penicillinase. When the inclusion rate of penicillinase and HP-β-CD was 1∶1， the inclusion reaction could act spontaneously. The synchronous fluorescence revealed that the complex of HP-β-CD and penicillinase was more intensity than that of penicillinase， and the fluorescence of penicillinase was mainly derived from tyrosine (Tyr) residue. The results of molecular docking showed that there were only three amino acid residues involved in the hydrogen bond formation， which were VAL39， ASN180 and ASP183．

HP-β-CD; penicillinase; molecular docking

2013-11-28.

國家自然科學(xué)基金項目(31370379).

1000-1190(2014)04-0532-06

O629.12

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: songfajun@mail.scuec.edu.cn.