楊 靜， 汪 超， 林親雄， 梅之南， 楊光忠， 楊新洲

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430074)

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苦參中l(wèi)avandulyl側(cè)鏈取代的黃酮抑制鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2活性的研究

楊 靜， 汪 超， 林親雄， 梅之南， 楊光忠， 楊新洲*

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430074)

對(duì)1個(gè)含400種中草藥和民族藥的組分庫(kù)進(jìn)行活性篩選，結(jié)果顯示苦參的乙酸乙酯萃取部位具有良好的抑制鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)的活性.在生物活性導(dǎo)向分離策略下，運(yùn)用制備型高效液相色譜技術(shù)對(duì)活性的乙酸乙酯萃取部位的成分進(jìn)行了分離純化，基于理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定了所分離的16個(gè)lavandulyl基取代黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并首次系統(tǒng)地報(bào)道了lavandulyl基取代黃酮的SGLT2抑制活性，活性部位中兩個(gè)主要成分(-)-kurarinone和sophoraflavanone G顯示出最強(qiáng)的SGLT2抑制活性，它們的IC50值分別為2.24 μmol/L和1.45 μmol/L．

苦參； 化學(xué)成分； Lavandulyl黃酮； SGLT2抑制劑

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素(Insulin)分泌或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂[1].Ⅱ型糖尿病占患者群體的90%以上，目前全世界糖尿病例約2.9億，成為繼心血管和腫瘤疾病之后，威脅人類健康的第3大疾病[2].在我國(guó)，已有9 200萬(wàn)糖尿病患者，患病率達(dá)9.7%，另有15.5%的人處在患病邊緣，給我國(guó)社會(huì)醫(yī)療保障體系帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)[3].

苦參是使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，它是豆科槐屬植物苦參(Sophoraflavescens)的根.苦參又名苦甘草、苦豆根、西豆根、野槐根、山槐根等.苦參性苦、寒，具清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效；用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢等.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦參主要含兩種化學(xué)成分：生物堿和黃酮，它們顯示多種生物活性和藥理功效[4-5]，一直受到各國(guó)藥學(xué)與化學(xué)工作者的關(guān)注.筆者對(duì)含400種中草藥和民族藥的組分庫(kù)的抑制鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)的活性篩選中發(fā)現(xiàn)，苦參的乙酸乙酯萃取部位顯示潛在的SGLT2抑制活性.運(yùn)用制備型高效液相技術(shù)對(duì)乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行活性導(dǎo)向的放大分離純化得到16個(gè)lavandulyl基取代的黃酮，基于理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)，分別鑒定為kushenol H(1)、kushenol K(2)、kurarinol(3)、kushenol Y(4)、kushenol P(5)、norkurarinone(6)、kushenol I(7)、kushenol N(8)、(-)-kurarinone(9)、kushenol X(10)、neokurarinol(11)、kushenol C(12)、sophoraflavanone G(13)、leachianone A(14)、kuraridine(15)、kushenol A(16).本文首次系統(tǒng)地報(bào)道了系列l(wèi)avandulyl基取代黃酮具有明顯的SGLT2抑制活性，并初步探討其構(gòu)效關(guān)系.所有的化合物均顯示出良好的SGLT2抑制活性，對(duì)SGLT2的抑制活性的IC50范圍在1.45 μmol/L和37.6 μmol/L之間，其中苦參乙酸乙酯部位的兩個(gè)主要成分(-)-kurarinone和sophoraflavanone G顯示出最強(qiáng)的SGLT2抑制活性，它們的IC50值分別為2.24 μmol/L和1.45 μmol/L．

1實(shí)驗(yàn)器材

1.1儀器與試劑

紫外光譜：Shimadzu UV-250型紫外光譜儀；質(zhì)譜：Finnigan MAT-95型質(zhì)譜儀，Q-TOF Micro LC-MS質(zhì)譜儀；核磁共振波譜：Bruker DRX-500 MHz核磁共振儀；中壓色譜制備系統(tǒng)：Alga公司；Waters 2535半制備制備型高效液相：2998二極管陣列檢測(cè)器，2707自動(dòng)進(jìn)樣器；Sunfire C18半制備柱(Waters，250 mm × 19 mm，5 μm)；薄層色譜硅膠和柱色譜硅膠：青島海洋化工廠；HPLC級(jí)甲醇和乙腈：Merck．

1.2植物材料

苦參(Sophoraflavescens)于2011年8月購(gòu)買于廣西南寧市水街中草藥藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西藥用植物園袁經(jīng)權(quán)副教授鑒定，藥材標(biāo)本(編號(hào)20110045SF)存放于中南民族大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館．

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1SGLT2抑制活性篩選[6-7]

以人正常腎組織Human cDNA(Invitrogen， Carlsbad， CA)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得Human SGLT2(hSGLT2)基因序列，將hSGLT2序列克隆到pCDNA3.1(+)載體得到質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中.通過(guò)對(duì)G418抵抗及對(duì)14C-α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷的吸收活性的測(cè)試篩選能穩(wěn)定表達(dá)hSGLT2的CHO細(xì)胞.鈉依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)測(cè)試：將穩(wěn)定表達(dá)hSGLT2的CHO細(xì)胞接種于96孔板中，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(接種密度為5×104個(gè)/孔)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后，細(xì)胞用預(yù)處理液(10 mmol/L HEPES，5 mmol/L Tris，140 mmol/L choline chloride，2 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，pH 7.4)在37℃孵育10 min.然后用含有14C-α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷(8.0 μmol/L)和抑制劑的吸收緩沖液(10 mmol/L HEPES，5 mmol/L Tris，140 mmol/L NaCl，2 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L AMG，pH 7.4)在37℃孵育細(xì)胞，2 h后用洗滌緩沖液(含有10 mmol/L的常溫預(yù)處理液)沖洗細(xì)胞兩次，然后用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量放射強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graph Pad PRISM.1軟件進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算IC50值．

2.2提取與分離

干燥的苦參根粉末30 g，倒入1根φ300 mm×40 mm的玻璃層析柱中，加入1 000 mL的分析純石油醚連續(xù)滲濾，流速為5 mL/min，以除去油脂類成分；石油醚滲濾完成后，加入1 500 mL分析純乙酸乙酯連續(xù)滲濾，流速為7 mL/min，滲濾完成后，滲濾液減壓濃縮得2.4 g乙酸乙酯萃取部位. 2.0 g乙酸乙酯萃取部位溶解于8.0 mL甲醇中，運(yùn)用制備型高效液相直接進(jìn)樣進(jìn)行分離，每次進(jìn)樣1.0 mL，選用Sunfire C18半制備柱(Waters，250 mm × 19 mm，5 μm)，采用混合流動(dòng)相(85%水∶15%乙腈→20%水∶80%乙腈，50 min，流速9.0 mL/min，其中兩相分別含0.1%甲酸)梯度洗脫，按照色譜峰洗脫順序進(jìn)行收集，重復(fù)上面的分離操作7次，合并保留時(shí)間相同的色譜峰，得到峰1(含化合物1和化合物2，Rt9.4 min)，峰2(含3，Rt10.4 min)，峰3(含4，Rt11.6 min)，峰4(含5，Rt12.5 min)，峰5(含6，Rt13.5 min)，峰6(含7和8，Rt14.4 min)，峰7(含9，Rt15.7 min)，峰8(含10，Rt17.3 min)，峰9(含11和12，Rt18.4 min)，峰10(含13，Rt19.3 min)，峰11(含14，Rt22.1 min)，峰12(含15，Rt23.2 min)，峰13(含16，Rt24.4 min).所有收集的色譜峰運(yùn)用葡聚糖LH-20柱(φ450 mm×10 mm)進(jìn)行再次純化得到純的化合物3(12.3 mg)，4(4.8 mg)，5(5.6 mg)，6(9.7 mg)，9(139 mg)，10(7.7 mg)，13(11.6 mg)，14(6.9 mg)，15(4.9 mg)，16(3.8 mg).峰1采用制備薄層層析法以混合展開劑(二氯甲烷∶甲醇∶甲酸=100∶10∶0.3)展開分離得到純的化合物1(7.1 mg)和化合物2(8.5 mg)；峰6采用制備薄層層析法以混合展開劑(二氯甲烷∶甲醇∶甲酸=120∶10∶0.3)展開分離得到純的化合物7(8.8 mg)和化合物8(5.7 mg)；峰9采用制備薄層層析法以混合展開劑(二氯甲烷∶甲醇∶甲酸=140∶10∶0.3)展開分離得到純的化合物11(6.2 mg)和化合物12(8.7 mg)．

3實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1基于制備型高效液相色譜的快速分離純化方法的建立

半制備和制備型高效液相色譜系統(tǒng)組成：Waters 2535液相系統(tǒng)、2998二級(jí)管陣列檢測(cè)器和2707自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters， Milford， MA， USA)，Sunfire C18半制備柱(Waters，250 mm × 19 mm，5 μmol/L).在室溫下，用含0.1%甲酸的水和乙腈兩相洗液以9.0 mL/min流速梯度洗脫，流動(dòng)相中乙腈線性梯度為30 min內(nèi)，從5%增加到100%(體積比)，在100%乙腈時(shí)維持5 min，進(jìn)樣EtOAc部位溶液20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍在200～400 nm之間，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，所得的色譜圖見(jiàn)圖1A.該色譜圖和積分?jǐn)?shù)據(jù)的記錄使用Empower 3色譜處理軟件．

基于進(jìn)樣少量乙酸乙酯萃取部位樣品色譜圖(圖1A)中各個(gè)色譜峰的分離情況，考慮到放大制備樣品的成本消耗，優(yōu)化的制備色譜條件為：采用同一根Sunfire C18半制備柱(250 mm × 19 mm，5 μmol/L)，在室溫下，用含0.1%甲酸的水和乙腈兩相洗液以9.0 mL/min流速梯度洗脫，流動(dòng)相中乙腈線性梯度為50 min內(nèi)，從15%增加到80%(體積比)，在50～55 min維持100%乙腈，進(jìn)樣乙酸乙酯萃取部位溶液1.0 mL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)范圍在200～400 nm之間，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，重復(fù)進(jìn)樣8次，所得的制備色譜圖見(jiàn)圖1B. 按照色譜峰洗脫順序進(jìn)行收集相應(yīng)的峰，減壓回收，采用葡聚糖LH-20柱層析和制備薄層層析方法繼續(xù)純化分離得到化合物1～化合物16．

圖1 (A) 苦參乙酸乙酯萃取部位在254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的Prep-HPLC圖譜(進(jìn)樣20 μL)； (B) 苦參乙酸乙酯萃取部位在254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的放大的Prep-HPLC圖譜(進(jìn)樣1.0 mL)Fig.1 (A) The preparative HPLC chromatography detected at 254 nm with the injection of 20 μL of the active EtOAc fraction; (B) The preparative HPLC chromatography detected at 254 nm with the injection of 1.0 mL of the active EtOAc fraction

3.2化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)將化合物1～化合物16的UV， LC-ESI-MS，1H 和13C NMR數(shù)據(jù)與相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道的進(jìn)行對(duì)照，鑒定16個(gè)化合物分別為kushenol H(1)[8，12]、kushenol K(2)[9]、kurarinol(3)[9]、kushenol Y(4)[10]、kushenol P(5)[11]、norkurarinone(6)[8]、(2R，3R)-8-1avandulyl-2'-methoxy-5，7，4'-trihydroxyflavanonol(7)[12]、kushenol N(8)[8]、(-)-kurarinone(9)[13]、kushenol X(10)[11]、neokurarinol(11)[13]、kushenol C(12)[14]、sophoraflavanone G(13)[13]、leachianone A(14)[15]、kuraridine(15)[8-9]、kushenol A(16)[13]，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2．

3.3SGLT2抑制活性

采用鈉-糖轉(zhuǎn)運(yùn)篩選方法[6-7]來(lái)評(píng)價(jià)從苦參乙酸乙酯萃取部位分離到的16個(gè)單體化合物抑制SGLT2的活性，選擇SGLT2抑制劑達(dá)格列靜(Dapagliflozin)作為陽(yáng)性對(duì)照.活性測(cè)試結(jié)果顯示，16個(gè)lavandulyl黃酮化合物均對(duì)SGLT2顯示一定的抑制活性(表1)，它們的IC50值在1.45和37.6 μmol/L之間，而苦參乙酸乙酯萃取部位的兩個(gè)主要成分(-)-kurarinone和sophoraflavanone G顯示出最強(qiáng)的SGLT2抑制活性，它們的IC50值分別為2.24 μmol/L和1.45 μmol/L. Lavandulyl黃酮化合物對(duì)SGLT2的抑制活性數(shù)據(jù)與這些化合物結(jié)構(gòu)之間顯示出初步的構(gòu)效關(guān)系，作為對(duì)照的兩個(gè)黃酮醇骨架的化合物quercetin和kaempferol不顯示任何活性，而所有具有l(wèi)avandulyl側(cè)鏈取代的黃酮1～16均顯示一定的SGLT2抑制活性，初步顯示8位上取代的lavandulyl側(cè)鏈?zhǔn)沁@些黃酮類成分SGLT2抑制活性的重要藥效團(tuán)；另外，lavandulyl側(cè)鏈上C-5"位有羥基取代的黃酮1～6對(duì)SGLT2抑制活性的IC50值范圍在14.6和37.6 μmol/L之間，而lavandulyl側(cè)鏈上C-5"位無(wú)羥基取代的黃酮7～16對(duì)SGLT2抑制活性的IC50值范圍在1.45和14.9 μmol/L之間，且其中大部分lavandulyl側(cè)鏈上C-5"位無(wú)羥基取代的黃酮對(duì)SGLT2抑制活性的IC50值都小于10 μmol/L，說(shuō)明黃酮lavandulyl側(cè)鏈上C-5"羥基的取代與其SGLT2抑制活性相關(guān)聯(lián)，lavandulyl黃酮側(cè)鏈上C-5"羥基的取代將減弱其SGLT2抑制活性.

圖2 苦參乙酸乙酯萃取部位中分離的化合物結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structures of 16 compounds from the EtOAc fraction of S. flavescens表1 16個(gè)化合物對(duì)SGLT2的抑制活性 結(jié)果(IC50， μmol/L; mean ±SD， n=3)Tab.1 Inhibitory activity against SGLT2 of sixteen compounds from S. flavescens

CompoundSGLT2InhibitionIC50/μmol/LCompoundSGLT2InhibitionIC50/μmol/L137.6±1.691013.2±1.18226.8±1.98115.64±0.43332.5±1.491214.9±1.31419.2±1.12131.45±0.08514.6±0.88146.83±0.44634.3±1.571511.2±0.9579.96±0.63164.85±0.25812.7±1.24QuercetinNAb92.24±0.17KaempferolNAbDapagliflozina0.035±0.002

a：Dapagliflozin作為陽(yáng)性對(duì)照； b：NA表示“無(wú)活性”．

4結(jié)論

本文直接運(yùn)用制備型高效液相色譜法對(duì)苦參的活性乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行了分離和純化，結(jié)合其他分離技術(shù)，快速得到16個(gè)lavandulyl黃酮類化合物，表明制備型高效液相技術(shù)對(duì)于包括苦參在內(nèi)的中草藥成分的分離和純化是一個(gè)非常強(qiáng)有力的工具.采用鈉-糖轉(zhuǎn)運(yùn)篩選方法測(cè)試了苦參乙酸乙酯萃取部位中分離的16個(gè)單體化合物的SGLT2抑制活性，這些lavandulyl黃酮化合物均顯示良好的SGLT2抑制活性，它們的IC50值范圍在1.45 μmol/L和37.6 μmol/L之間.對(duì)這些化合物的SGLT2抑制活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的初步構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了探討，建議lavandulyl側(cè)鏈也許是這些黃酮類成分的SGLT2抑制活性的重要藥效團(tuán)，lavandulyl側(cè)鏈上羥基的取代將減弱其SGLT2抑制活性.進(jìn)一步的體內(nèi)抗糖尿病活性研究正在進(jìn)行中．

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Lavandulyl flavonoids with sodium-dependent glucose cotransporter 2 inhibitory activity fromSophoraflavescens

YANG Jing， WANG Chao， LIN Qinxiong， MEI Zhinan， YANG Guangzhong， YANG Xinzhou

(College of Pharmacy， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074)

To discover new bioactive Sodium-dependent glucose cotransporter 2 (SGLT2) inhibitors from the traditional Chinese medicine “Ku Shen” (roots ofSophoraflavescens)， the bioassay-guided purification of an active ethyl acetate fraction was performed. Sixteen lavandulyl flavonoids were isolated and their structures were elucidated as kushenol H (1)， kushenol K (2)， kurarinol (3)， kushenol Y (4)， kushenol P (5)， norkurarinone (6)， kushenol I (7)， kushenol N (8)， (-)-kurarinone (9)， kushenol X (10)， neokurarinol (11)， kushenol C (12)， sophoraflavanone G (13)， leachianone A (14)， kuraridine (15) and kushenol A (16). All isolated compounds exhibited inhibitory activity against SGLT2. Among them， the two main constituents of the active EtOAc fraction，(-)-kurarinone (9) and sophoraflavanone G (13) showed the most potential inhibitory activity against SGLT2 with theIC50values of 2.24 μmol/L and 1.45 μmol/L， respectively．

Sophoraflavescens; chemical constituents; lavandulyl flavonoids; SGLT2 inhibitors

2014-01-22.

武漢市青年科技晨光計(jì)劃(2013070104010028)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102798)； 人事部留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助項(xiàng)目(BZY12006).

1000-1190(2014)04-0520-05

R284.1

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: yxzyxz01@163.com.