張囡，楊靜嫻，孫東，胡昱，趙丹，李紅艷，康廷國

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

·藥學(xué)研究· PHARMACEUTICAL RESEARCH

牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張囡，楊靜嫻，孫東，胡昱，趙丹，李紅艷，康廷國*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

目的：考察牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：用蛋白激酶A抑制劑H89處理SH-SY5Y細(xì)胞，建立細(xì)胞損傷模型。將SH-SY5Y細(xì)胞分成正常組（正常細(xì)胞）、模型組（經(jīng)H89處理的細(xì)胞）、H89+牛蒡苷元組（經(jīng)H89處理后給予牛蒡苷元處理的細(xì)胞）和H89+丹酚酸B組（陽性對照組，經(jīng)H89處理后給予丹酚酸B處理的細(xì)胞）。采用MTT法檢測細(xì)胞活力、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞中β-淀粉樣肽和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的表達(dá)以及Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：H89誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型造模成功。牛蒡苷元在低濃度（0.5 μmol · L-1）時(shí)對細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用最佳，與模型組相比，H89+低濃度牛蒡苷元組細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著提高（P＜0.01），細(xì)胞中β-淀粉樣肽的表達(dá)下調(diào)5.17%（P＜0.05），而神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的表達(dá)上調(diào)80.54%（P＜0.01），凋亡細(xì)胞百分比也顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：低濃度牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用。

牛蒡苷元；H89；SH-SY5Y細(xì)胞；細(xì)胞活力；β-淀粉樣肽；神經(jīng)營養(yǎng)因子-3；細(xì)胞凋亡

環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其經(jīng)磷酸化（p-CREB）后即被激活，從而調(diào)節(jié)下游多種神經(jīng)營養(yǎng)因子及促存活基因的轉(zhuǎn)錄，對神經(jīng)細(xì)胞的成熟、存活和功能起著關(guān)鍵作用[1-3]。CREB可被多種信號通路激活，其中蛋白激酶A（PKA）信號通路是激活CREB的經(jīng)典通路，而H89（N-[2-( p-bromocinnamylamino) ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide·2HCl hydrate）是PKA選擇性抑制劑，可通過抑制PKA而抑制CREB的磷酸化，并誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[4-5]。

菊科草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）始載于《本草圖經(jīng)》，其藥性辛、苦、寒，歸肺、胃經(jīng)，具有辛涼解表、疏風(fēng)散熱、宣肺祛痰、解毒消腫等功效。牛蒡苷和牛蒡苷元（Arctigenin，Arc）是其成熟干燥果實(shí)——牛蒡子中重要的藥理活性成分，在體內(nèi)，牛蒡苷轉(zhuǎn)化為Arc而產(chǎn)生生物活性。已有研究報(bào)道Arc可在抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗細(xì)胞氧化性損傷等方面發(fā)揮積極作用[6]，但其對損傷的神經(jīng)細(xì)胞有無保護(hù)作用，卻鮮有報(bào)道。本文采用PKA抑制劑H89抑制CREB磷酸化，建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型[4]，考察H89對SH-SY5Y細(xì)胞活力、β-淀粉樣肽（β-amyloid, Aβ）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）表達(dá)以及細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討Arc對H89誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院贈(zèng)；H89（Cell Signaling 公司）；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司）；兔抗人Aβ35-42單克隆抗體（一抗，Bioss公司）；雞抗人NT-3單克隆抗體（一抗，Stem-Cell Technologies公司）；Cy3標(biāo)記羊抗兔和羊抗雞免疫球蛋白G（IgG）（二抗，Jackson Immuno Research公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、Hoechst 33258染色液（Sigma公司）；丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）（Santa Cruz公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司）；NIB-100F型倒置熒光顯微鏡（寧波永新光學(xué)有限公司）；冷CCD數(shù)碼相機(jī)、IS-Capture軟件（福州圖森圖像公司）；Image J分析軟件[美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）]。

2 方法

2.1 牛蒡苷元的制備

牛蒡子購自大連海王星辰藥店，并經(jīng)筆者所在學(xué)校中藥鑒定教研室康廷國教授鑒定確認(rèn)。參照文獻(xiàn)[7]，將牛蒡子粉碎，過40目（0.42 mm）篩后，用10倍體積的3%鹽酸水解3 h，過濾；將濾渣水洗至中性，低溫烘干，用6倍體積的30%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾；合并濾液，回收溶劑后，進(jìn)硅膠柱層析，以CH2Cl2/MeOH為洗脫劑，梯度洗脫（CH2Cl2: MeOH→100 : 0→100 : 1），其中CH2Cl2: MeOH為100 : 1時(shí)所得餾分經(jīng)溶劑回收、放置，得到無色片狀結(jié)晶物，再經(jīng)多次重結(jié)晶，最終獲得經(jīng)HPLC檢測而測得純度大于98%的Arc。

2.2 SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)、分組與給藥處理

取第5代SH-SY5Y細(xì)胞，按每毫升6×105個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，并在37℃和5%CO2環(huán)境條件下，用完全培養(yǎng)基（含DMEM/F12、10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)3 d，用于實(shí)驗(yàn)。

參照文獻(xiàn)[8-10]，取上述培養(yǎng)的細(xì)胞分成正常組（正常細(xì)胞）、模型組（將正常細(xì)胞用50 μmol·L-1H89孵育24 h）、H89+Arc組（即Arc治療組，將正常細(xì)胞先用50 μmol·L-1H89預(yù)處理1 h，再加入0.1～10 μmol·L-1Arc，共孵育24 h）及H89+ Sal B組（即陽性對照組，將正常細(xì)胞先按H89+Arc組方法用H89預(yù)處理，再加入10 μmol·L-1Sal B，共孵育24 h）。

2.3 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞活力

在各組SH-SY5Y細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入MTT 10 μL，于37℃孵育4 h，棄去含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜（DMSO）150 μL，1 h后用酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定吸光度值，平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。將正常組吸光度值所表征的細(xì)胞活力計(jì)為100%，其余各組吸光度值與之相比而測得相對細(xì)胞活力。

2.4 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ和NT-3的表達(dá)

參照文獻(xiàn)[11]，在各組SH-SY5Y細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每組取3孔培養(yǎng)的細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1% Triton X-100透化20 min，加入一抗（1:100），于4 ℃過夜，次晨用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，加入Cy3標(biāo)記特異二抗（1:200），于室溫放置60 min，再用PBS洗滌后，加入含DAPI（1 μmol·L-1）的封片劑封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，每孔取10個(gè)隨機(jī)視野，并通過Image J 軟件對各組細(xì)胞中Aβ35-42或NT-3陽性表達(dá)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描和定量，平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。

2.5 Hoechst 33258染色法檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率

參照文獻(xiàn)[10]，在各組SH-SY5Y細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每組取3孔培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)固定、透化后，加入Hoechst33258染色液（0.5 mg·L-1，pH 7.4），于避光、室溫條件下孵育30 min，用PBS洗滌，封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核，用Image J 細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，平行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活力下降的抑制作用

MTT法檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低[(61.90±9.67)% vs 100%，P＜0.05]，而H89+低濃度Arc（0.1、0.25、0.5 μmol·L-1）組細(xì)胞的細(xì)胞活力較模型組明顯提高，達(dá)（99.57±9.78）% ～（99.86±1.75）%（P＜0.01），與H89+ Sal B組相當(dāng)，其中H89+0.5 μmol·L-1Arc組細(xì)胞的細(xì)胞活力最高，說明低濃度Arc對H89誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞活力下降具有顯著抑制作用；但H89+高濃度Arc（1、5、10 μmol·L-1）組細(xì)胞的細(xì)胞活力卻隨培養(yǎng)板中Arc濃度的升高而逐漸降低，尤其H89+10 μmol·L-1Arc組細(xì)胞的細(xì)胞活力僅為（55.12±18.03）%，與模型組相當(dāng)，說明高濃度Arc會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性（見圖1）。

圖1 各組細(xì)胞活力比較（n=9）Figure 1 Comparison of cell vitalities among all groups

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，0.5 μmol·L-1為Arc對抗H89誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的最佳濃度。故以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中H89+Arc組所用Arc濃度均為0.5 μmol·L-1。

3.2 牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ表達(dá)上調(diào)的抑制作用

Aβ免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果可見，各組細(xì)胞胞漿中均有Aβ表達(dá)（紅色熒光）， 其中模型組細(xì)胞的紅色熒光最明亮且密集，幾乎連成片狀，而H89+Arc組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較模型組明顯減弱（見圖2）。進(jìn)一步的Image J軟件定量分析顯示，模型組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比正常組增大16.73%（P＜0.01），說明被H89損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ水平顯著升高；而H89+Arc組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較模型組減小5.17%（P＜0.05），與H89+ Sal B組相當(dāng)，說明Arc能顯著抑制H89誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ水平升高（見圖3）。

圖2 各組細(xì)胞經(jīng)Aβ免疫熒光染色后的顯微圖像（×40）Figure 2 Microscope images of the cells after Aβ immunofluorescence staining in all groups

圖3 各組細(xì)胞經(jīng)Aβ免疫熒光染色后的熒光強(qiáng)度比較（n=9）Figure 3 Comparison of fluorescence intensities of the cells after Aβ immunofluorescence staining among all groups

3.3 牛蒡苷元對SH-SY5Y細(xì)胞中NT-3表達(dá)的促進(jìn)作用

NT-3免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測結(jié)果可見，正常組、模型組、H89+Arc組和H89+ Sal B組細(xì)胞中NT-3的表達(dá)（紅色熒光）依次增多（見圖4）。進(jìn)一步的Image J軟件定量分析顯示，正常組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較弱，而模型組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較之增大62.35%（P＜0.05），說明被H89損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中NT-3的表達(dá)明顯上調(diào)；H89+Arc組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度則又較模型組進(jìn)一步增大80.54%（P＜0.01），與H89+ Sal B組相當(dāng)，說明SH-SY5Y細(xì)胞受損傷后能代償性上調(diào)NT-3的表達(dá)水平，而Arc卻可進(jìn)一步顯著促進(jìn)受損傷的SH-SY5Y細(xì)胞中NT-3的表達(dá)（見圖5）。

圖4 各組細(xì)胞經(jīng)NT-3免疫熒光染色后的顯微圖像（×40）Figure 4 Microscope images of the cells after NT-3 immunofluorescence staining in all groups

圖5 各組細(xì)胞經(jīng)NT-3免疫熒光染色后的熒光強(qiáng)度比較（n=9）Figure 5 Comparison of fluorescence intensities of the cells after NT-3 immunofluorescence staining amongall groups

3.4 牛蒡苷元對H89誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用

Hoechst 33258染色法檢測結(jié)果可見，模型組中細(xì)胞凋亡核（箭頭所指半月形或呈碎塊狀致密濃染的細(xì)胞核）最多，而H89+Arc組細(xì)胞凋亡核明顯減少（見圖6）。進(jìn)一步的Image J 細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量分析顯示，模型組中凋亡細(xì)胞百分比為（27.33±1.15）%，顯著高于正常組的(3.67±1.15)%（P＜0.01)； 而H89+Arc組中凋亡細(xì)胞百分比為（17.33±1.53）%，顯著低于模型H89組（P＜0.05），但略高于H89+ Sal B組，說明Arc能有效對抗H89誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡（見圖7）。

圖6 各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后的顯微圖像（×40）Figure 6 Microscope images of the cells after Hoechst 33258 staining in all groups

圖7 各組中凋亡細(xì)胞百分比比較（n=9）

4 討論

CREB可被多種蛋白激酶催化形成p-CREB而被激活，而PKA是調(diào)控CREB磷酸化的經(jīng)典通路，有實(shí)驗(yàn)證明該過程對腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[12]，其機(jī)制可能與 p-CREB能誘導(dǎo)細(xì)胞存活基因bcl-2表達(dá)有關(guān)[13]。H89是PKA選擇性抑制劑，可通過抑制PKA降低p-CREB水平[14]，而p-CREB水平下降則能導(dǎo)致其下游促細(xì)胞存活的基因轉(zhuǎn)錄受阻，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[15]。

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是嚴(yán)重威脅人類晚年生活質(zhì)量的主要疾病之一，至今缺乏有效治療方法。Aβ異常聚集是引起AD腦內(nèi)病變的重要原因之一，其腦內(nèi)水平升高可下調(diào)p-CREB水平，誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[16]。但腦內(nèi)p-CREB水平下降是否可引起Aβ水平升高，至今尚無報(bào)道。本文以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，采用PKA抑制劑H89抑制PKA活性以下調(diào)p-CREB水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在p-CREB水平下調(diào)的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Aβ的表達(dá)也增多，說明細(xì)胞內(nèi)p-CREB水平的下降能誘導(dǎo)Aβ聚集；而經(jīng)低濃度Arc干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)Aβ明顯減少，說明Arc能顯著對抗H89誘導(dǎo)p-CREB水平下降所致Aβ水平升高，對緩解AD腦內(nèi)神經(jīng)元損傷有積極作用。

NT-3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，是神經(jīng)元存活所必需的因子，對神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[17]。本文的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在正常SH-SY5Y細(xì)胞中，NT-3表達(dá)水平較低；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)H89損害24 h后，NT-3表達(dá)水平升高，這可能是細(xì)胞自身的保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制所致[17]，但這種自身調(diào)節(jié)并不足以逆轉(zhuǎn)損傷細(xì)胞的病理過程，需用其他手段來增強(qiáng)NT-3表達(dá)；當(dāng)用低濃度Arc干預(yù)后，受損細(xì)胞中NT-3含量顯著增加，這可能與p-CREB水平升高，促進(jìn)了NT-3的表達(dá)有關(guān)。

Hoechst 33258染色法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H89處理的SHSY5Y細(xì)胞中凋亡核數(shù)目明顯增多，說明H89對SH-SY5Y細(xì)胞造成了損傷，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而受損細(xì)胞經(jīng)低濃度Arc處理后，其凋亡核數(shù)目明顯，說明Arc能有效抑制H89誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，H89可通過抑制PKA，下調(diào)p-CREB水平，引起神經(jīng)細(xì)胞中Aβ水平升高和凋亡數(shù)目增加；而低濃度Arc能對抗H89的損傷作用，致使受損細(xì)胞中p-CREB水平上調(diào)， Aβ水平下調(diào)，減輕Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的損害，且同時(shí)促進(jìn)下游存活基因和NT-3的表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，從而發(fā)揮其對神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。提示，Arc有可能成為候選的神經(jīng)保護(hù)藥物，在相關(guān)新藥研發(fā)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Protective Effect of Arctigenin against H89-induced SH-SY5Y Cell Injury

ZHANG Nan, YANG Jingxian, SUN Dong, HU Yu, ZHAO Dan, LI Hongyan, KANG Tingguo
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China)

Objective:To investigate the protective effect of arctigenin against H89-induced human neuroblastoma SH-SY5Y cell injury. Methods: SHSY5Y cells were treated with PKA inhibitor H89 to establish the cell injury model. SH-SY5Y cells were divided into normal group (normal cells), model group (H89-treated cells), H89+Arc group (H89- and arctigenin-treated cells) and H89+ Sal B group (positive control group, H89- and salvianolic acid B-treated cells). The cell vitality, the expression of β-amyloid (Aβ) and neurotrophin-3 (NT-3) in cells and cell apoptosis rate were determined respectively by MTT assay, immunofuorescence cytochemistry staining technique and Hoechst33258 staining method. Results: The H89-induced cell injury model was successfully established. Arctigenin exerted a maximal protective effect on the cell injury model at low concentration (0.5 μmol·L-1). Compared with model group, the cell vitality was signifcantly increased (P＜0.01) , the expression of Aβ in cells was down-regulated by 5.17% (P＜0.05) , the expression of NT-3 in cells was up-regulated by 80.54% (P＜0.01) and the percentage of apoptotic cells was also signifcantly decreased (P＜0.05) in H89+ Arc (0.5 μmol·L-1) group. Conclusion: Arctigenin has a signifcant protective effect against H89-induced SH-SY5Y cell injury at low concentration.

arctigenin; H89; SH-SY5Y cell; cell vitality; β-amyloid; neurotrophin-3; cell apoptosis

R285.5; R742

B

1001-5094（2014）03-0215-05

接受日期：2013-11-11

項(xiàng)目資助：十一五國家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目（No. 2009ZX09103-423）

*通訊作者：康廷國，教授；

研究方向：中藥鑒定及中藥的品質(zhì)評價(jià)；

Tel：0411-87586078； E-mail：kangtg@lnutcm.edu.cn