吳海波 才志剛 張紹明 張珩 汪雷 徐小平

(中國(guó)人民解放軍第四五五醫(yī)院心胸外科，上海 200052)

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展與結(jié)腸細(xì)胞的炎性反應(yīng)密切相關(guān)。長(zhǎng)期慢性炎性反應(yīng)能夠促使結(jié)腸細(xì)胞過(guò)度增殖，引起DNA的不可逆損傷，進(jìn)而啟動(dòng)并促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫抑制[1]。結(jié)腸癌細(xì)胞炎性反應(yīng)的發(fā)生與Toll樣受體、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素-6 (IL-6)等多種分子的表達(dá)異常密切相關(guān)[2-3]。最近有研究[4]表明，腫瘤局部炎性反應(yīng)的發(fā)生與微小核糖核酸microRNAs(miRNAs)的異常表達(dá)有關(guān)。miRNAs是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的單鏈小分子RNA，能夠與其他分子組裝成沉默復(fù)合體 (RISC)。RISC通過(guò)作用于mRNA的3′端非編碼區(qū)，可抑制翻譯或直接促使mRNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)，進(jìn)而參與機(jī)體的生理病理過(guò)程[5-7]。本研究探討了miRNAs在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞炎性反應(yīng)模型中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)混合液購(gòu)自日本TOYOBO 公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，三氯甲烷、異丙醇、乙醇購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，高糖型DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及炎性反應(yīng)誘導(dǎo) HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞增殖達(dá)培養(yǎng)皿底的80%時(shí)，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，0.25% EDTA-胰酶消化細(xì)胞；加入培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，按每孔2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后，加入終濃度為400 ng/mL的LPS，孵育48 h后收獲細(xì)胞(LPS組)。將未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞總RNA抽提 將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的HT-29細(xì)胞用預(yù)冷的PBS漂洗后，加入1 mL Trizol室溫裂解5 min；將裂解后的細(xì)胞移至離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈混勻，室溫放置2 min；12 000 r/min 4 ℃離心15 min，上層水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中；向離心管中加入1 mL的異丙醇，-20 ℃沉淀過(guò)夜；12 000 r/min 4 ℃離心15 min，可見(jiàn)白色的沉淀，棄上清液，以75%乙醇清洗RNA斑塊，7500 r/min于4 ℃離心5 min，棄上清，自然晾干，以無(wú)RNA酶的水溶解。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA的表達(dá) 先應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄引物(頸環(huán)結(jié)構(gòu))將miRNAs反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用實(shí)時(shí)熒光(SYBR染料)定量PCR檢測(cè)miRNAs的表達(dá)量。PCR結(jié)束后，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法，計(jì)算各樣本的miRNAs的相對(duì)濃度。miRNAs反轉(zhuǎn)錄及定量PCR引物序列見(jiàn)表1～2。

表1 miRNAs反轉(zhuǎn)錄引物序列

表2 miRNAs定量PCR引物序列

2 結(jié) 果

圖1 LPS組與對(duì)照組IL-6和CRP的表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.1 HT-29細(xì)胞炎性反應(yīng)模型的建立 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，LPS組細(xì)胞中IL-6和CRP的表達(dá)水平較對(duì)照組高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞炎性反應(yīng)模型建立成功。見(jiàn)圖1。

2.2 miRNAs在兩組細(xì)胞中的表達(dá)水平 通過(guò)文獻(xiàn)[8-10]分析，我們初步篩選了在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用的miRNAs，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將miR-22、miR-23、miR-24、miR-26、miR-30、miR-181和miR-214作為檢測(cè)對(duì)象。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LPS組細(xì)胞中miR-22、miR-26、miR-214的表達(dá)水平較對(duì)照組低，而miR-23的表達(dá)較對(duì)照組高(P<0.05)；兩組miR-24、miR-30、miR-181的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，aP<0.05, bP<0.01

3 討 論

miRNAs參與結(jié)腸癌發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)，miR-21的表達(dá)從癌前病變到晚期癌組織逐漸增加[11]；miR-135a和miR-135b通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[12]；miR-21和miR-196a參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控[13-14]。

由于結(jié)腸癌是一種炎性反應(yīng)相關(guān)性腫瘤，本實(shí)驗(yàn)研究了結(jié)腸癌細(xì)胞受到LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)刺激后，miRNA表達(dá)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組細(xì)胞中miR-22、miR-26、miR-214的表達(dá)較對(duì)照組下降(P<0.05)，miR-23的表達(dá)則升高，提示miRNAs參與結(jié)腸癌的局部炎性反應(yīng)。雖然本研究中miR-24、miR-30、miR-181在LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞炎性反應(yīng)模型中表達(dá)未發(fā)生改變，但這并不代表這些miRNAs在結(jié)腸癌細(xì)胞炎性反應(yīng)中不發(fā)揮作用。因此，miRNAs在不同類型的結(jié)腸癌細(xì)胞炎性反應(yīng)模型中的表達(dá)和功能仍有待于進(jìn)一步探討。

目前，臨床上已經(jīng)開(kāi)始將多種抗炎藥物，如糖皮質(zhì)激素、維生素D3受體激動(dòng)劑、趨化因子拮抗劑、非類固醇類抗炎藥等試驗(yàn)性應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和癌癥的輔助治療[9-10]，而在腫瘤炎性反應(yīng)起到關(guān)鍵作用的細(xì)胞、細(xì)胞因子和酶等都有潛力作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。隨著在腫瘤炎性反應(yīng)中miRNA研究的深入，其有望成為控制結(jié)腸癌炎性反應(yīng)的新靶點(diǎn)，以miRNA為靶點(diǎn)的新型抗癌藥也將在抑制腫瘤的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

[1]Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation[J]. Nature,2008，454(7203): 436-444.

[2]Machida K, Tsukamoto H, Mkrtchyan H, et al. Toll-like receptor 4 mediates synergism between alcohol and HCV in hepatic oncogenesis involving stem cell marker Nanog [J]. Proc Nat l Acad Sci USA，2009，106(5):1548-1553.

[3]Sun Q, Liu Q, Zheng Y, et al. Rapamycin suppresses TLR4-triggered IL-6 and PGE(2) production of colon cancer cells by inhibiting TLR4 expression and NF-kappaB activation [J]. Mol Immunol,2008, 45(10):2929-2936.

[4]馬一杰，陳貝貝，尚藝曼，等. microRNA在大腸癌診治中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012,9(15)：8-23.

[5]Nie J, Liu L,Zheng W, et al. microRNA-365, down-regulated in colon cancer, inhibits cell cycle progression and promotes apoptosis of colon cancer cells by probably targeting Cyclin D1 and Bcl-2 [J]. Carcinogenesis,2012, 33(1): 220-225.

[6]Zhang L, Volinia S, Bonome T,et al. Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2008, 105(19): 7004-7009.

[7]Frankel LB, Christoffersen NR,Jacobsen A, et al.Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells [J]. J Biol Chem,2008, 283(2): 1026-1033.

[8]Nesaretnam K, Meganathan P. Tocotrienols: inflammation and cancer [J]. Ann N Y Acad Sci,2011, 1229(1):18-22.

[9]Mbeunkui F, Johannn DJ Jr. Cancer and the tumor microenvironment: a review Of an essential relationship [J]. Cancer Chemother pharmacol, 2009, 63(4):571-582.

[10]Umezawa K. Possible role of peritoneal NF-K B in peripheral inflammation and cancer: Lessons from the inhibitor DHMEQ [J]. Biomed Pharmacother, 2011, 65(4):252-259.

[11]Yamamichi N, Shimomura R, Inada K, et al. Locked nucleic acid in situ hybridization analysis of miR-21 expression during colorectal cancer development [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(12):4009-4016.

[12]Nagel R, le Sage C, Diosdado B, et al. Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer [J]. Cancer Res, 2008, 68(14):5795-5802.

[13]Schimanski CC, Frerichs K, Rahman F, et al. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells[J].World J Gastroenterol, 2009,15(17):2089-2096.

[14]Asangani IA, Rasheed SA, Nikolova DA, et al. MicroRNA-21 (miR-21) post transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion, intravasation and metastasis in colorectal cancer[J].Oncogene, 2008, 27(15):2128-2136.