申 源，葉樹(shù)虹，汪 莉，陳受惠

(江西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330022)

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DNA與CdS-NH2納米粒子的相互作用研究

申 源，葉樹(shù)虹，汪 莉，陳受惠*

(江西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330022)

采用熒光光譜、紫外光譜(UV-vis)、圓二色譜(CD)、透射電鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)研究CdS-NH2-EcoRI復(fù)合物與DNA的相互作用.研究發(fā)現(xiàn)： CdS-NH2納米粒子與pBR322DNA結(jié)合后會(huì)延遲EcoRI的酶切反應(yīng).DNA的曲率和納米粒子的粒徑都是影響結(jié)合作用的因素,曲率較大的環(huán)狀DNA比線性DNA能更好地與納米粒子結(jié)合,小粒徑的CdS-NH2納米粒子則更易結(jié)合到DNA上.并研究了DNA與CdS-NH2納米粒子之間的作用機(jī)理.

CdS-NH2；EcoRI；DNA；CdS-NH2-EcoRI復(fù)合物；熒光光譜；圓二色譜；原子力顯微鏡；瓊脂糖凝膠電泳

0 引言

發(fā)光量子點(diǎn)納米粒子(如CdSe、ZnS、CdS納米晶體)具有顯著的光催化穩(wěn)定性和一些優(yōu)越特性(量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等),被廣泛用于生物定向研究[1-4],如J.F.Campbell等將CdSe/ZnS納米粒子與包裹在碳納米管上的DNA結(jié)合,利用量子點(diǎn)的發(fā)光特性確定DNA的位置[5].CdS納米粒子在生物化學(xué)、生物傳感器等相關(guān)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,因此其與DNA之間相互作用的研究備受關(guān)注[6].

CdS納米粒子與DNA等生物大分子的結(jié)合常被應(yīng)用于生物試驗(yàn)和生物傳感器的研究.通常對(duì)其表面進(jìn)行必要的修飾來(lái)提高其生物兼容性,已報(bào)道有許多方法能夠提高這些納米材料的水溶性等[7-8],如二氧化硅涂層[9-10]、結(jié)合親水配體[11-12].不同的修飾方法能夠提高或改變納米粒子的相應(yīng)性能,增強(qiáng)生物兼容性[13-14],從而提高其應(yīng)用價(jià)值.如帶有親水基團(tuán)的半導(dǎo)體納米粒子因其能夠有效地識(shí)別熒光能量的定向轉(zhuǎn)移而在定向研究上具有廣闊的應(yīng)用前景,有望被應(yīng)用于細(xì)胞攝取等[7,15].在眾多的報(bào)道中,對(duì)小粒徑的CdS納米粒子采取改變修飾官能團(tuán)的方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單,具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值.如K. Susumu等將納米粒子的末端修飾了氨基、羧基等幾種不同的官能團(tuán),能夠更好地與蛋白素結(jié)合[16].

本文合成了CdS-NH2納米粒子,結(jié)合UV-vis[17]、CD[18]、AFM[19]、瓊脂糖凝膠電泳[20]等技術(shù)手段,研究了線性λDNA和環(huán)狀pBR322DNA與CdS-NH2納米粒子之間的相互作用.結(jié)果顯示CdS-NH2納米粒子與DNA之間同樣發(fā)生了溝槽結(jié)合作用,同時(shí)—NH2與DNA分子的磷酸骨架之間還存在著氫鍵作用,促進(jìn)了CdS-NH2納米粒子與DNA的結(jié)合.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和實(shí)驗(yàn)

λ-DNA(48 502 bp)、pBR322DNA(4 361 bp)、λ-HindIII digest DNA Marker (with bands of 23 130,9 416,6 557,4 361,2 322 and 2 027 bp)、TAE緩沖液(40 mmol·L-1Tris-Acetate,2 mmol·L-1EDTA)、EcoRI (大腸桿菌 RY13)、瓊脂糖等購(gòu)于中國(guó)大連TaKaRa生物試劑公司；GelRed Nucleic Acid Gel stain (10000X in water)購(gòu)于美國(guó)Biotium公司；Na2S·9H2O和CdCl2,購(gòu)于上海阿拉丁；L-半胱氨酸(Cys,97%)購(gòu)于Sigma-Adlrich.其他試劑均購(gòu)于中國(guó)北京化學(xué)試劑公司.所有試劑使用前均沒(méi)有進(jìn)一步純化,溶液均由超純水(>18 MΩ·cm) 配制.云母(KAl12(AlSi3)O10(OH)2)購(gòu)于中國(guó)長(zhǎng)春.

儀器:上海愛(ài)建AJ-III型原子力顯微鏡;FEI公司Technai S-twin透射電子顯微鏡;伯樂(lè)Mini-PROTEAN電泳儀;Perkin-Elmer Lambda 35紫外分光光度儀;Perkin-Elmer LS 55 luminescence熒光分光光度儀;Bio-Logic公司MOS-450/AF-CD圓二色譜儀.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 CdS-NH2納米粒子的制備 CdS-NH2納米粒子的合成方法參照文獻(xiàn)[21-23],合成過(guò)程如圖1所示.將1.0 mmol·L-1的Cys溶于100 mL超純水中,在攪拌的條件下通入氮?dú)?0 min.用0.5 mol·L-1Tris 調(diào)控溶液的pH值在8.5～9.0之間.隨后緩慢加入0.5 mmol·L-1的CdCl2溶液,使n(Cys)∶n(Cd2+)=2∶1,攪拌反應(yīng)30 min后加入10 mL 0.5 mmol·L-1的Na2S溶液,溶液呈無(wú)色.然后密封在47 ℃水浴下孵育2 h,這時(shí)溶液轉(zhuǎn)為澄清的黃綠色.隨后通入N230 min以除去未反應(yīng)完全的Na2S.所得CdS-NH2溶液在室溫下保存.由于合成過(guò)程中溶液pH值在8.5～9.0之間,大于等電點(diǎn)5.05,CdS-NH2納米粒子表面帶負(fù)電荷.該納米粒子粒徑大小,可通過(guò)調(diào)節(jié)S/Cd2+物質(zhì)的量之比來(lái)控制[23].本工作中分別選取n(S)∶n(Cd2+)為1∶1和1∶2,制備了粒徑約1.8 nm和4.2 nm的納米粒子.

圖1 CdS-NH2納米粒子合成示意圖

1.2.2 樣品的光譜分析 合成的CdS溶液在60 ℃條件下真空干燥得到CdS粉末,取適量與KBr研磨壓片后在干燥恒溫的條件下進(jìn)行傅立葉紅外光譜測(cè)定.相關(guān)參數(shù)設(shè)定為DTGS檢測(cè)器,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為32次.

配制一定濃度的DNA溶液和CdS-NH2溶液,DNA與CdS-NH2的混合溶液均置于37 ℃的恒溫水浴中孵育30 min后使用.使用1 cm石英比色皿,測(cè)試的波長(zhǎng)范圍為200 ～ 600 nm.

配制5.0 ng·μL-1λ-DNA、0.1 mmol·L-1CdS溶液、一定濃度的KI溶液.DNA與CdS-NH2的混合溶液均置于37 ℃的恒溫水浴中孵育30 min后使用.使用1 cm 石英比色皿,在375 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)試400～700 nm范圍的熒光光譜.

配制20.0 ng·μL-1λ-DNA和0.2 mmol·L-1的CdS-NH2溶液.DNA與CdS-NH2的混合溶液均置于37 ℃的恒溫水浴中孵育30 min.使用1 cm 石英比色皿,以200 nm.min-1的速度在200～400 nm的范圍內(nèi)掃描圓二色譜.

1.2.3 樣品的TEM表征 用超純水配制0.5 mmol·L-1CdS-NH2溶液,取約15 μL均勻傾倒于400目的銅網(wǎng)上,室溫干燥后在200 kV的加速電壓下進(jìn)行HRTEM檢測(cè).

1.2.4 樣品的AFM表征 首先剪切大小約為1 cm×1 cm的云母,使用前確保其表面拋光無(wú)明顯裂紋.然后將1.0 ng·μL-1λ-DNA溶液、1.0 ng·μL-1pBR322DNA溶液分別與1 mmol·L-1CdS-NH2溶液混合,分別加入1 mmol·L-1醋酸鈣溶液,在37 ℃條件下恒溫孵育30 min.然后,分別取約30 μLλ-DNA-CdS-NH2、pBR322DNA-CdS-NH2溶液滴于新粘制的云母上,吸附約13 min后,依次用1∶1超純水/無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醇沖洗5次左右,置于干燥器內(nèi)干燥即可.AFM選用輕敲模式,在室溫條件下操作,采用標(biāo)準(zhǔn)的硅探針(力常數(shù)0.6～6.0 N·m-1),其共振頻率為60～150 kHz.

1.2.5 樣品的瓊脂糖凝膠電泳表征 使用1%瓊脂糖在120 V電壓下進(jìn)行約25 min的電泳測(cè)試.測(cè)試中使用4 μL GelRed進(jìn)行染色,使用TAE緩沖液(40 mmol·L-1Tris-Acetate,2 mmol·L-1EDTA).

配制40 ng Marker,40 ng DNA溶液,1 mmol·L-1CdS-NH2溶液,將DNA-CdS-NH2混合液在37 ℃條件下恒溫孵育.使用1 U EcoRI和DNA以及復(fù)合物于37 ℃恒溫孵育不同時(shí)間后進(jìn)行酶切反應(yīng).

2 結(jié)果與討論

2.1 CdS-NH2納米粒子的表征

圖2 (A)CdS-NH2納米粒子的TEM圖；(B)CdS-NH2納米粒子紅外光譜圖

將合成的2種粒徑大小的CdS-NH2納米粒子進(jìn)行AFM表征和紫外光譜測(cè)試,結(jié)果如圖3所示.由于量子點(diǎn)尺寸效應(yīng),CdS-NH2特征吸收峰位置由515 nm藍(lán)移至380 nm和480 nm,如圖3(A)和圖3(C)所示[26].所得的CdS-NH2納米粒子的尺寸可根據(jù)Brus公式[27]進(jìn)行計(jì)算：

E=Egbulk+?2/8r2(1/mom*e+1/mom*h)-

1.8e2/4πεεor，

(1)

其中Egbulk為體相材料能隙,?為普朗克常量,r為粒子半徑,m*e為電子有效質(zhì)量,m*h為空穴有效質(zhì)量,mo為自由電子有效質(zhì)量,e為自由電子有效電荷,εo為空穴介電常數(shù),ε為相對(duì)介電常數(shù).由此算得CdS-NH2納米粒子粒徑分別為1.76 nm和4.13 nm.

原子力顯微鏡(AFM)用于表征CdS-NH2納米粒子的形貌特征,如圖3(A)和圖3(C)所示,表征了2種不同粒徑大小的CdS-NH2納米粒子,圖中CdS-NH2納米粒子較均勻的分布在云母表面.這2圖分別對(duì)應(yīng)于圖3(B)和圖3(D)中納米粒子TEM圖.從圖中能直觀地得出CdS-NH2納米粒子的粒徑大小分別為(1.78±0.03) nm和(4.23±0.05) nm.

圖3 (A)、(B)為小粒徑CdS-NH2納米粒子的AFM表征圖、TEM圖;(C)、(D)為大粒徑CdS-NH2納米粒子的AFM表征圖、TEM圖.插圖為CdS-NH2納米粒子紫外光譜圖

2.2 CdS-NH2納米粒子與DNA的相互作用

紫外光譜法是一種判斷CdS-NH2納米粒子與DNA之間相互作用的模式的簡(jiǎn)單檢測(cè)方法.如果小分子與DNA之間是嵌插結(jié)合,那么加入DNA后小分子的紫外吸收峰會(huì)發(fā)生較為明顯的紅移和減色效應(yīng)[28]；若是靜電結(jié)合或溝槽結(jié)合,則紫外吸收峰發(fā)生微弱的減色效應(yīng),峰位置一般不紅移或紅移不明顯[29].圖4(A)和圖4(B)分別為1.0 mmol·L-1CdS-NH2與5 ng·μL-1λ-DNA、5 ng·μL-1pBR322DNA相互作用的紫外光譜圖.圖4中約375 nm處為CdS-NH2納米粒子的紫外吸收峰位置.隨著DNA的加入,CdS-NH2納米粒子在375 nm處的吸收峰發(fā)生了減色效應(yīng),這表明CdS-NH2納米粒子與DNA之間發(fā)生了相互作用[28-30].相比線性λ-DNA,同濃度的環(huán)狀pBR322DNA與CdS-NH2結(jié)合后,CdS-NH2吸收峰減色更加明顯,這反映了曲率更大的環(huán)狀DNA與納米粒子的結(jié)合作用比線性DNA分子稍強(qiáng).根據(jù)CdS-NH2納米粒子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)判斷CdS-NH2納米粒子與DNA的磷酸骨架之間存在著氫鍵作用.該氫鍵作用一定程度上增強(qiáng)了CdS-NH2納米粒子與DNA的結(jié)合作用.

圖4 (A) λ-DNA(5 ng·μL-1),CdS-NH2(1.0 mmol·L-1)-λ-DNA(5 ng·μL-1)紫外光譜圖.(B) pBR322DNA(5 ng·μL-1),CdS-NH2-pBR322DNA紫外光譜圖

本文使用熒光猝滅法來(lái)進(jìn)一步判斷CdS-NH2納米粒子與DNA之間的作用方式.帶負(fù)電的DNA磷酸骨架能夠排斥帶負(fù)電的猝滅劑.若小分子與DNA是嵌插結(jié)合,則小分子嵌插進(jìn)入DNA分子雙鏈中在一定程度上保護(hù)了其熒光不被猝滅,使猝滅程度減弱[31];若是溝槽結(jié)合,則小分子的熒光強(qiáng)度很容易被陰離子猝滅劑猝滅[32].猝滅劑KI常用于判斷小分子與DNA的結(jié)合方式,通過(guò)計(jì)算比較KI對(duì)CdS-NH2納米粒子、CdS-NH2-DNA體系的熒光猝滅常數(shù)可得到相應(yīng)的結(jié)論.圖5分別是KI對(duì)CdS-NH2納米粒子、CdS-NH2-DNA體系的熒光猝滅情況.根據(jù)Stern-Volmer方程可計(jì)算熒光猝滅常數(shù)[32]:

勞動(dòng)最光榮，勞動(dòng)最崇高，勞動(dòng)最偉大，勞動(dòng)最美麗。逐夢(mèng)新征程，唱響新時(shí)代的奮斗者之歌，工會(huì)組織要為勞動(dòng)模范、大國(guó)工匠發(fā)揮作用搭建平臺(tái)、提供舞臺(tái)，為勞模工匠傳承技能、傳承精神創(chuàng)造條件，培養(yǎng)造就更多勞動(dòng)模范、大國(guó)工匠。要大力弘揚(yáng)勞模精神、勞動(dòng)精神、工匠精神，讓誠(chéng)實(shí)勞動(dòng)、勤勉工作蔚然成風(fēng)，引導(dǎo)廣大職工以勞動(dòng)和創(chuàng)造托起中國(guó)夢(mèng)。

圖5 KI對(duì)0.1 mmol·L-1 CdS-NH2納米粒子、CdS-NH2 (0.1 mmol·L-1)-DNA(5 ng·μL-1)體系的猝滅常數(shù)線性圖.KI的濃度為0.8,1.6,2.4,3.2,4.0 mmol·L-1.

F0/F= 1 +KSV[Q],

(2)

其中F0為KI不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度,F為加入KI后的熒光強(qiáng)度,KSV為猝滅常數(shù),[Q]為猝滅劑濃度.根據(jù)公式(2),由F0/F對(duì)[Q]作工作曲線,得到CdS-NH2納米粒子、CdS-NH2-DNA體系的熒光猝滅常數(shù)分別為3.9×105L·mol-1和9.4×105L·mol-1.這說(shuō)明CdS-NH2納米粒子與DNA結(jié)合后,KI對(duì)其的熒光猝滅程度不但沒(méi)有減弱,反而增強(qiáng).結(jié)果證明CdS-NH2納米粒子與DNA之間為溝槽結(jié)合.

為深入探究CdS-NH2納米粒子與DNA之間的結(jié)合方式,本文研究了單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)對(duì)CdS-NH2納米粒子的熒光猝滅效果,如圖6所示.試驗(yàn)中將dsDNA在沸水中加熱10 min之后迅速置于冷水中,即可得到ssDNA.若是靜電結(jié)合,ssDNA和dsDNA對(duì)CdS-NH2納米粒子具有相同的猝滅效果;若是嵌插結(jié)合(小分子嵌插入dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中),由于ssDNA沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu),無(wú)法實(shí)現(xiàn)嵌插結(jié)合,ssDNA對(duì)CdS-NH2納米粒子的猝滅效果將很微弱；若是溝槽結(jié)合(小分子通過(guò)疏水作用力結(jié)合到DNA分子的溝槽當(dāng)中),由于ssDNA的堿基對(duì)大量的暴露出來(lái),將增強(qiáng)小分子與DNA堿基對(duì)之間的作用力,ssDNA對(duì)CdS-NH2納米粒子的猝滅效果將增強(qiáng)[33-34].從圖6可以看出,與dsDNA相比,ssDNA對(duì)CdS-NH2納米粒子的猝滅作用明顯更強(qiáng).這證明了CdS-NH2納米粒子與DNA的結(jié)合方式是溝槽結(jié)合.

圖6 dsDNA和ssDNA對(duì)0.1 mmol·L-1 CdS-NH2納米粒子的Stern-Volmer熒光猝滅圖

圓二色譜技術(shù)能夠反映小分子與DNA發(fā)生結(jié)合作用后DNA結(jié)構(gòu)的變化情況.B構(gòu)型DNA在遠(yuǎn)紫外區(qū)(220～320 nm)能夠表現(xiàn)出特定的圓二色譜圖形[35],結(jié)合作用導(dǎo)致的DNA結(jié)構(gòu)的變化能夠直接表現(xiàn)為圓二色譜峰形的變化.從圖7可以看出,λ-DNA在約276 nm處有一正峰(由于堿基堆積),約246 nm處有一負(fù)峰(由于不對(duì)稱的核苷酸的螺旋結(jié)構(gòu)),這說(shuō)明λ-DNA是典型的B構(gòu)型DNA[35].小分子與DNA溝槽結(jié)合對(duì)DNA的堿基堆積和螺旋結(jié)構(gòu)影響很小或者沒(méi)有影響,不影響其構(gòu)型[36].而發(fā)生嵌插作用時(shí)可削弱DNA堿基之間的π-π堆積作用使雙螺旋結(jié)構(gòu)變得松散,因而CD譜中的正負(fù)峰有明顯的變化.CdS-NH2納米粒子在遠(yuǎn)紫外區(qū)沒(méi)有圓二色譜特征峰.由圖7可知,λ-DNA與CdS結(jié)合后,λ-DNA在276 nm和246 nm處的峰形幾乎沒(méi)有發(fā)生變化,這證明CdS-NH2對(duì)λ-DNA的構(gòu)型沒(méi)有產(chǎn)生影響,與溝槽結(jié)合的作用方式相符合.

圖7 λ-DNA(20 ng·μL-1),CdS-NH2(0.2 mmol·L-1)-λ-DNA(20 ng·μL-1)圓二色光譜圖

AFM是用于表征DNA與小分子之間相互作用形貌結(jié)構(gòu)的常用儀器[37-38],它能夠清晰準(zhǔn)確直觀地反映樣品表面的形貌,掃描尺度精細(xì),像素清晰.圖8為DNA與CdS-NH2納米粒子結(jié)合后的形貌特征.其中(A)、(B)為λ-DNA與不同粒徑的CdS-NH2納米粒子結(jié)合的形貌圖，(C)為pBR322DNA與小粒徑CdS-NH2納米粒子結(jié)合的形貌圖.圖8(A)中顯示與DNA結(jié)合的CdS-NH2粒徑主要集中在(0.98±0.02) nm左右,結(jié)合數(shù)量較多;圖8(B)中顯示與DNA結(jié)合的CdS-NH2粒徑主要集中在(2.82±0.15) nm左右,結(jié)合數(shù)量較少.對(duì)比圖8(A)、圖8(B),表明并非所有粒徑大小的CdS-NH2納米粒子都能羅好地與DNA結(jié)合,粒徑尺寸較大的CdS-NH2納米粒子與DNA的結(jié)合數(shù)量較少.結(jié)果表明DNA在不同直徑大小的CdS-NH2納米粒子中能夠選擇其中一種粒徑CdS-NH2納米粒子結(jié)合,存在氫鍵作用并沒(méi)有改變這一特點(diǎn).

(A)CdS-NH2(1.76 nm)-λ-DNA(1.0 ng·μL-1)形貌圖;(B)CdS-NH2(4.13 nm)-λ-DNA(1.0 ng·μL-1)形貌圖.插圖為結(jié)合到λ-DNA上的CdS-NH2粒徑分布柱狀圖;(C) CdS-NH2(1.76 nm)-pBR322DNA(1.0 ng·μL-1)形貌圖,插圖為pBR322DNA長(zhǎng)度柱狀統(tǒng)計(jì)圖.

小分子與DNA若是嵌插結(jié)合,則會(huì)導(dǎo)致DNA分子鏈增長(zhǎng),而溝槽結(jié)合則不會(huì)影響DNA分子的長(zhǎng)度.圖8(C)中插圖為pBR322DNA長(zhǎng)度柱狀統(tǒng)計(jì)圖,由圖可知，與CdS-NH2納米粒子結(jié)合后pBR322DNA長(zhǎng)度約為1.28 μm,與未結(jié)合的DNA長(zhǎng)度一致，該結(jié)果證明它們之間為溝槽結(jié)合.采用統(tǒng)計(jì)分析的方法,選取粒徑約為1 nm的CdS-NH2納米粒子來(lái)統(tǒng)計(jì)分析CdS-NH2納米粒子與DNA的結(jié)合數(shù)量.圖(A)中λ-DNA鏈上平均每微米約有3個(gè)CdS-NH2納米粒子；圖(C)中pBR22DNA分子上平均每微米約有4.5個(gè)CdS-NH2納米粒子.對(duì)比發(fā)現(xiàn)CdS-NH2納米粒子與環(huán)狀的pBR322DNA結(jié)合數(shù)量較線性的λ-DNA結(jié)合數(shù)量更大.有文獻(xiàn)報(bào)道，由于環(huán)狀質(zhì)粒DNA比線性DNA分子具有更大的曲率和更小的剛性,接觸作用面積更大，與其它分子結(jié)合消耗的能量更小，因此能更好地結(jié)合[39].同時(shí)發(fā)現(xiàn)，較小粒徑的CdS-NH2納米粒子也更容易與環(huán)狀pBR322DNA發(fā)生溝槽結(jié)合作用

另外,CdS-NH2納米粒子與DNA結(jié)合數(shù)量較大,這與—NH2與DNA分子磷酸骨架之間存在氫鍵促進(jìn)了結(jié)合作用的推斷相符合.

2.3 CdS-NH2納米粒子對(duì)EcoRI與DNA酶切作用的影響

EcoRI是一種常用的限制性核酸內(nèi)切酶,通過(guò)識(shí)別DNA鏈上的特定堿基序列位點(diǎn)(GAATTC)對(duì)DNA進(jìn)行酶切作用[40-41].在37 ℃條件下恒溫1 h(1×H緩沖液)1 U EcoRI能夠剪切1 μgλ-DNA、0.4 μg pBR322DNA.CdS-NH2納米粒子與DNA通過(guò)靜電結(jié)合后,是否會(huì)影響蛋白質(zhì)(EcoRI)對(duì)DNA的剪切作用,從而對(duì)EcoRI剪切DNA這一生物活性是否有影響,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)試結(jié)果,分析不同條帶的DNA分子片段(如不同大小DNA分子片段,環(huán)狀或線性等不同形狀)便可得出結(jié)論.

圖9(B)為CdS-NH2納米粒子與DNA相互作用凝膠電泳圖.作為圖9(A)的對(duì)照,圖9(B)中λ-DNA、pBR322DNA與CdS-NH2納米粒子結(jié)合孵育1.5 h后DNA的電泳條帶位置均沒(méi)有變化,這表明CdS-NH2納米粒子對(duì)DNA沒(méi)有剪切作用.

如圖9(A)所示,泳道1為λ-DNA,泳道2、3分別為恒溫37 ℃ 1.0 h、1.5 h后EcoRI對(duì)CdS-NH2-λ-DNA酶切反應(yīng).泳道3中出現(xiàn)了5條不同位置的條帶,這說(shuō)明泳道3中的λ-DNA被EcoRI剪切成了5條不同分子大小的片段,而泳道2中的λ-DNA沒(méi)有被剪切.這證明CdS-NH2納米粒子與λ-DNA結(jié)合后對(duì)EcoRI的剪切作用產(chǎn)生了一定的影響,阻礙了酶切反應(yīng)的進(jìn)行,使在1.0 h內(nèi)EcoRI對(duì)λ-DNA沒(méi)有發(fā)生酶切作用.但隨著時(shí)間的增加(至1.5 h)EcoRI仍然能夠識(shí)別λ-DNA上的酶切位點(diǎn)并進(jìn)行酶切作用.由泳道5、6可以看出，在恒溫孵育1.0 h時(shí)酶切反應(yīng)沒(méi)有發(fā)生,直到恒溫孵育1.5 h發(fā)生了酶切反應(yīng),即環(huán)狀pBR322DNA被EcoRI剪切開(kāi)環(huán),CdS-NH2納米粒子與pBR322DNA結(jié)合后對(duì)EcoRI的生物活性的影響效果比較顯著.這可能是由于CdS-NH2與DNA除了靜電結(jié)合外還存在氫鍵作用,使得pBR322DNA上結(jié)合了更多數(shù)量的CdS-NH2納米粒子,一定程度上阻礙了EcoRI在pBR322DNA上結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別,從而影響了剪切作用.這一現(xiàn)象表明納米粒子與DNA分子的這種非特異性結(jié)合能夠阻礙EcoRI對(duì)其在DNA鏈上的結(jié)合位點(diǎn)的特異性識(shí)別,而DNA上的這種非特異性結(jié)合的納米粒子數(shù)量越多,對(duì)EcoRI酶活性的影響越顯著,并且對(duì)堿基對(duì)較少的質(zhì)粒DNA的酶切作用影響更加明顯.

泳道1～6分別為：λ-DNA、EcoRI與λ-DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.0 h,EcoRI與λ-DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.5 h、pBR322DNA,EcoRI與pBR322DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.0 h,EcoRI與pBR322DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.5 h.(B)CdS-NH2納米粒子與DNA相互作用凝膠電泳圖.泳道1～5分別是λ-DNA、λ-DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.5 h,CdS-NH2、pBR322DNA、pBR322DNA-CdS-NH2恒溫孵育1.5 h.

3 結(jié)論

本文使用紫外光譜、熒光光譜、圓二色譜、透射電鏡、原子力顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)手段,研究了CdS-NH2納米粒子與2種DNA(線性λ-DNA和環(huán)狀pBR322DNA)之間的相互作用.結(jié)果表明DNA與CdS-NH2納米粒子之間為溝槽結(jié)合和氫鍵作用；DNA的曲率和納米粒子的粒徑都是影響結(jié)合作用的因素(曲率較大的環(huán)狀DNA比線性DNA能更好的與納米粒子結(jié)合,粒徑為1 nm左右的CdS-NH2納米粒子更容易結(jié)合到DNA上)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CdS-NH2納米粒子能影響EcoRI對(duì)DNA的酶切作用,從而延遲EcoRI對(duì)DNA的酶切反應(yīng).本文為研究納米粒子與DNA相互作用的動(dòng)力學(xué)提供參考.

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(責(zé)任編輯：劉顯亮)

TheStudyontheInteractionsbetweenDNAandCdS-NH2Nanoparticles

SHEN Yuan,YE Shu-hong,WANG Li,CHEN Shou-hui*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Jiangxi Normal University,Nanchang Jiangxi 330022,China)

In this work,the interaction between DNA and CdS-NH2-EcoRI composites was investigated by infrared spectroscopy,UV-vis spectroscopy,fluorescence spectroscopy,CD spectroscopy,atomic force microscope,agarose gel electrophoresis,etc.It was shown that the restriction enzyme reaction of EcoRI would be retarded after CdS-NH2nanoparticles combined with pBR322DNA.Both the curvature of DNA and the particle size of nanoparticles are the crucial factors influencing the groove binding.Circular-like DNA with larger curvature is more easily combined with nanoparticles than linear DNA.And CdS-NH2nanoparticles with smaller size were more easily combined with DNA.The interaction mechanism of DNA and CdS-NH2nanoparticles was also studied in this work.

CdS-NH2;EcoRI;DNA;CdS-NH2-EcoRI composites;fluorescence spectroscopy;CD spectroscopy;atomic force microscope;agarose gel electrophoresis

2014-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(2105005)，江西省教育廳科技課題(GJJ10389)和江西師范大學(xué)青年成長(zhǎng)基金(5487)資助項(xiàng)目.

陳受惠(1978-)，男，江西南昌人，講師，主要從事光譜分析研究.

1000-5862(2014)06-0624-08

Q 523;TB 383.1

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