張清明，馮瑞芝，2，張保華，劉鑫剛，王 智

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島266109；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院，陜西 楊凌712100）

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，由于其具有耐鹽特性，從而適宜在相對(duì)鹽堿土地上種植。黃河三角洲地區(qū)土壤在不同程度上有一定的鹽堿特征，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中更適合于一些耐鹽植物的種植。因此，目前棉花已成為黃河三角洲地區(qū)的主要農(nóng)作物之一［1］。由于該地區(qū)土壤特征有其特殊性，農(nóng)藥等外源污染物的引入勢(shì)必會(huì)對(duì)該地區(qū)土壤生態(tài)產(chǎn)生一定程度的影響。土壤微生物是維持土壤生態(tài)功能的重要組成部分，與土壤肥力和土壤健康有著密切聯(lián)系，其數(shù)量多少與酶活性的高低在很大程度上能反映出土壤物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度，因此土壤微生物數(shù)量和土壤酶經(jīng)常被用來作為評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的重要指標(biāo)。土壤微生物活性與土壤類型［2］、土地利用方式［3］、施肥［4］、農(nóng)藥［5］等外源污染物影響關(guān)系密切。農(nóng)藥作為農(nóng)田環(huán)境中主要的外源污染物之一，其對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境的影響已引起越來越多的環(huán)境和土壤學(xué)領(lǐng)域相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。吡蟲啉作為煙堿類超高效殺蟲劑，主要用于防治蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式害蟲，在棉花、小麥、水稻等作物中廣泛應(yīng)用。因此吡蟲啉對(duì)土壤環(huán)境的影響也有一些相關(guān)報(bào)道，例如劉慧君等［6］研究表明土壤呼吸強(qiáng)度對(duì)吡蟲啉較為敏感，使用初期會(huì)對(duì)土壤呼吸有強(qiáng)烈的抑制作用，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑制作用逐漸消失。鄭巍等［7］發(fā)現(xiàn)低濃度吡蟲啉對(duì)土壤過氧化氫酶有抑制作用，而高濃度有激活作用。Singh等［8］研究了吡蟲啉對(duì)花生田土壤中脫氫酶和堿性磷酸酶的影響，結(jié)果表明吡蟲啉處理種子播種15～60d內(nèi)能顯著提高土壤中這兩種酶的活性。而吡蟲啉對(duì)于黃河三角洲地區(qū)相對(duì)鹽堿類型土壤的影響尚未見報(bào)道，因此本文以黃河三角洲棉田土壤為研究對(duì)象，排除天氣、植物根系及其他因素，利用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)定鹽脅迫下不同濃度吡蟲啉對(duì)土壤微生物數(shù)量和幾種酶活性的影響，探明其中的規(guī)律，以期為吡蟲啉對(duì)鹽堿土壤環(huán)境的安全評(píng)價(jià)及合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%），由德國 Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為分析純。SHP－250型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JA5003N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 土壤樣品

供試土壤采集于黃河三角洲地區(qū)山東省濱州市濱城區(qū)梁才街道灘部村棉田。取樣方法采用五點(diǎn)法，采集過程中除去土壤表面的雜草、枯葉和1cm左右的表層土后，采集耕作層約為20cm厚度的土壤。采集回來的土壤樣品先剔除石塊和植物體等雜物，再經(jīng)自然風(fēng)化，過1mm篩。完全混合后放置4℃?zhèn)溆?。土壤為沙壤土，pH 值為7.65，有機(jī)質(zhì)14.2g／kg，有機(jī)氮97.6mg／kg，速效磷13.6mg／kg，速效鉀112.7 mg／kg，含鹽量0.09%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤的預(yù)處理與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 向過篩后的土壤樣品中加入蒸餾水，使其含水量達(dá)到最大持水量的60%。完全混勻后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14d，恢復(fù)其生物學(xué)特性。文獻(xiàn)檢索表明吡蟲啉在土壤中的初始?xì)埩袅恳话阍?0μg／g以下，因此本試驗(yàn)中吡蟲啉共設(shè) 4 個(gè)施藥劑量 （0，0.4，2.0，10 μg／g），添加鹽的濃度設(shè)置為0，0.3%兩個(gè)處理。每個(gè)處理均設(shè)置三次重復(fù)，其處理如表1所示。

表1 供試土壤的處理

1.3.2 土壤染毒 稱取約1 000g預(yù)培養(yǎng)的土壤，分出約100g土壤，按表1所示的處理濃度分別加入不同濃度的以乙腈為溶劑的吡蟲啉工作溶液和氯化鈉固體，混合均勻后，再將這100g土壤混入剩余的土壤中，使土壤混合均勻，調(diào)節(jié)其含水量為最大持水量的60%，分裝250ml棕色試劑瓶中（每瓶裝約100 g土壤），放于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每隔2d調(diào)節(jié)一次水含量，使之保持恒定。藥劑處理后分別于7，14，21，28d測(cè)定土壤微生物的數(shù)量和土壤酶的活性。

1.3.3 土壤微生物數(shù)量的測(cè)定 微生物數(shù)量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法［9］。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌采用改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，選取每皿30～300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果以每克干土中的菌落平均數(shù)表示。

1.3.4 土壤酶活性的測(cè)定 土壤堿性磷酸酶的活性采用磷酸苯二鈉比色法，酶活性單位用PNP（對(duì)硝基苯）μg／g干土表示；土壤脲酶活性測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，酶活性單位以NH4－Nμg／g干土表示；土壤中的β－葡萄糖苷酶活性采用對(duì)硝基酚－β－D－吡喃葡糖苷比色法測(cè)定，具體操作方法參照文獻(xiàn)［10－12］。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2007和SPSS 19.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同一時(shí)間不同處理之間的差異采用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)棉田土壤微生物數(shù)量的影響

2.1.1 吡蟲啉對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響如表2所示，土壤中細(xì)菌的數(shù)量與吡蟲啉的處理濃度、處理時(shí)間有關(guān)。低鹽土壤中，和對(duì)照相比，施0.4，2，10μg／g吡蟲啉7d后，細(xì)菌數(shù)量顯著增加，這可能與培養(yǎng)初期吡蟲啉為細(xì)菌提供了刺激其生長的碳源和能源有關(guān)。而14d后中濃度（2μg／g）和高濃度（10μg／g）吡蟲啉處理的土壤中細(xì)菌數(shù)量明顯減少，在21d時(shí)達(dá)到最小，細(xì)菌數(shù)量分別比對(duì)照減少了32.3%和35.6%，出現(xiàn)這種情況可能是吡蟲啉降解產(chǎn)物抑制了土壤中細(xì)菌的生長。在添加0.3%鹽時(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)吡蟲啉對(duì)土壤中細(xì)菌數(shù)量表現(xiàn)出一定的刺激作用，特別是在7d時(shí)，0.4，2.0，10μg／g吡蟲啉處理的土壤中細(xì)菌數(shù)量和對(duì)照相比分別增加了13.8%，44.3%，79.9%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在28d時(shí)除10μg／g吡蟲啉處理組外，其他濃度吡蟲啉處理組中細(xì)菌數(shù)量均恢復(fù)到對(duì)照水平。這可能是鹽能鈍化吡蟲啉的降解從而降低了吡蟲啉降解產(chǎn)物對(duì)土壤細(xì)菌生長的抑制作用，此推測(cè)還需進(jìn)一步研究。從兩種鹽處理土壤細(xì)菌數(shù)量上進(jìn)行比較，在添加0.3%鹽的土壤中細(xì)菌數(shù)量明顯少于不加鹽的土壤，這說明鹽的存在對(duì)細(xì)菌有毒性作用，本文發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了周玲玲等［13］的觀點(diǎn)。

2.1.2 吡蟲啉對(duì)土壤放線菌數(shù)量的影響 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤放線菌數(shù)量的影響見表3。由表3可知，在28d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，不同濃度吡蟲啉處理土壤中放線菌數(shù)量顯著低于對(duì)照水平，且吡蟲啉濃度越大，放線菌數(shù)量越少，這說明吡蟲啉及其降解產(chǎn)物對(duì)放線菌有一定的毒性作用，從而產(chǎn)生了抑制作用。而在添加0.3%鹽的土壤中，與對(duì)照相比，三個(gè)濃度的吡蟲啉在7，14，21d對(duì)放線菌有顯著的刺激作用（p＜0.05），且吡蟲啉的濃度越大刺激作用越強(qiáng)，特別是在14d時(shí)，這種刺激作用達(dá)到最大，和對(duì)照相比土壤中放線菌數(shù)量分別增加了26.5%，65.6%，135.1%。這可能與鹽脅迫下鈍化了吡蟲啉對(duì)放線菌的毒性，反而為其提供了生長的營養(yǎng)源有關(guān)。28d時(shí)，0.4，2 μg／g吡蟲啉處理組土壤中放線菌數(shù)量逐漸恢復(fù)到對(duì)照水平，10μg／g吡蟲啉依然對(duì)供試土壤中放線菌有顯著的刺激作用（p＜0.05）。這說明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和吡蟲啉的降解，土壤中可供利用的碳源和能源逐漸減少，從而較低濃度吡蟲啉處理土壤中放線菌數(shù)量逐漸和對(duì)照趨于一致。

表2 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

2.1.3 吡蟲啉對(duì)土壤真菌數(shù)量的影響 由表4可知，本實(shí)驗(yàn)所供試的棉田土壤中真菌數(shù)量明顯偏少，這可能與所采集土壤的理化性質(zhì)有關(guān)，經(jīng)測(cè)定本實(shí)驗(yàn)供試土壤的pH為7.65，呈弱堿性，從而導(dǎo)致真菌數(shù)量少于中性和弱酸性土壤中真菌數(shù)量［14］。吡蟲啉對(duì)供試土壤中真菌數(shù)量影響不大，僅在7d和14d時(shí)，10μg／g吡蟲啉對(duì)土壤中真菌表現(xiàn)出一定的刺激作用，14d后各濃度吡蟲啉處理土壤中真菌數(shù)量和對(duì)照無顯著差異（p＜0.05）。在添加0.3%鹽土壤下，吡蟲啉對(duì)真菌的影響和不加鹽土壤真菌數(shù)量變化基本一致，這說明吡蟲啉對(duì)土壤中真菌數(shù)量的影響和土壤中鹽濃度關(guān)系較小。

表3 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤放線菌數(shù)量的影響

表4 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤真菌數(shù)量的影響

2.2 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)棉田土壤酶活性的影響

2.2.1 吡蟲啉對(duì)土壤堿性磷酸酶活性的影響 磷酸酶在土壤中以中性磷酸酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶三種形式存在，所在環(huán)境不同，磷酸酶也表現(xiàn)出不同的活性［15］。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用土壤為黃河三角洲棉田土壤，其鹽含量相對(duì)較高，土壤呈弱堿性。因此本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)評(píng)價(jià)了吡蟲啉對(duì)堿性磷酸酶活性的影響。由圖1A可知，與對(duì)照相比，三個(gè)濃度的吡蟲啉只在21 d時(shí)對(duì)堿性磷酸酶有激活作用，且吡蟲啉的濃度越大，酶的活性越強(qiáng)，酶活性最大增加了14.9%；在7，14，28d時(shí)，吡蟲啉對(duì)堿性磷酸酶的活性無顯著性影響。這可能與供試土壤中P含量偏低有關(guān)［16］，同時(shí)也說明吡蟲啉在弱堿性環(huán)境下對(duì)堿性磷酸酶活性影響較小。當(dāng)供試土壤中添加0.3%鹽時(shí)，0.4，2μg／g的吡蟲啉在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)對(duì)堿性磷酸酶活性的影響與對(duì)照相比無顯著性變化；但10μg／g吡蟲啉處理組土壤中堿性磷酸酶活性在4個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)均顯著提高（p＜0.05），酶活性增加了8.8%～12.9%（圖1B）?？梢酝茰y(cè)相對(duì)高濃度鹽的存在改變了土壤環(huán)境，從而使吡蟲啉對(duì)堿性磷酸酶活性的影響發(fā)生改變，但是不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用。

2.2.2 吡蟲啉對(duì)土壤脲酶活性的影響 脲酶作為唯一催化尿素在土壤中的轉(zhuǎn)化和生化作用的酶，與土壤生物化學(xué)循環(huán)中的氮循環(huán)密切相關(guān)，氨作為植物氮素營養(yǎng)來源之一是脲酶水解尿素而成，如果土壤中脲酶活性過低，將會(huì)影響土壤中尿素的利用率，若活性過高，會(huì)造成植物的氨中毒，對(duì)土壤肥力和作物的生長也不利［17］。由圖2A 可知，與對(duì)照相比，0.4，2μg／g的吡蟲啉在7，14d時(shí)對(duì)脲酶活性無顯著影響，在21，28d時(shí)有顯著的激活作用（p＜0.05），且濃度越大激活作用越強(qiáng)，脲酶活性最大分別提高了6.2%和9.7%；10μg／g吡蟲啉處理組在7，14d時(shí)土壤中脲酶活性顯著高于對(duì)照水平（p＜0.05），酶活性增加了12.9%，10.4%，而在21，28d酶活性低于對(duì)照水平，酶活性分別降低了14.7%，4.5%。由于不同土壤肥力條件下，不同殺蟲劑對(duì)土壤脲酶的影響效果不一樣，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，可以推測(cè)吡蟲啉對(duì)脲酶活性有刺激作用，且濃度越大，尿素水解高峰期出現(xiàn)的越早，高濃度吡蟲啉的降解產(chǎn)物可能對(duì)脲酶活性有抑制作用，從而在試驗(yàn)后期脲酶的活性有所降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道的吡蟲啉對(duì)大棚土壤脲酶活性影響的結(jié)果相似［18］。當(dāng)土壤中添加0.3%鹽時(shí)，與對(duì)照相比，三個(gè)濃度的吡蟲啉處理只在14d對(duì)脲酶活性有明顯的抑制作用（p＜0.05），且與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，酶活性分別降低了5.8%，21.4%，32.6%；其他時(shí)間脲酶活性無顯著性變化（圖2B）?？梢钥闯鲈谔砑?.3%鹽脅迫下，吡蟲啉對(duì)脲酶活性的影響明顯降低，這說明鹽的存在鈍化了吡蟲啉對(duì)土壤中微生物的影響從而降低了對(duì)脲酶活性的影響。

圖1 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤堿性磷酸酶活性的影響

圖2 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤脲酶活性的影響

2.2.3 吡蟲啉對(duì)土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響 β－葡萄糖苷酶也是土壤中重要的酶之一，其被認(rèn)為是纖維素降解中最重要的一種酶，與土壤碳代謝密切相關(guān)，它的酶促產(chǎn)物——葡萄糖是植物、微生物的營養(yǎng)源，因此β－葡糖苷酶活性可以表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度［19］。本研究結(jié)果表明，在未加鹽的土壤中，0.4μg／g的吡蟲啉對(duì)β－葡萄糖苷酶活性沒有影響，2，10μg／g吡蟲啉對(duì)酶活性有顯著的抑制作用（p＜0.05），酶活性降低了9.2%～17.7%，表現(xiàn)出一定的毒性作用（圖3A）。當(dāng)土壤中添加0.3%鹽時(shí)，三個(gè)濃度的吡蟲啉只在14d對(duì)β－葡萄糖苷酶有顯著的激活作用（p＜0.05），酶活性分別增加了15.1%，19.6%，13.4%（圖3B），整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)有抑制作用，這說明鹽的存在能改變吡蟲啉對(duì)土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響，主要表現(xiàn)為可以減小其對(duì)β－葡萄糖苷酶的毒性。但該推測(cè)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 鹽脅迫下吡蟲啉對(duì)土壤β－葡萄糖苷酶活性的影響

3 結(jié)論

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，吡蟲啉施用前期對(duì)細(xì)菌生長有促進(jìn)作用，后期有抑制作用，農(nóng)藥的濃度越大，后期的抑制作用越強(qiáng)；添加鹽時(shí)，后期的抑制作用消失，只表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌的促進(jìn)作用。吡蟲啉對(duì)放線菌有抑制作用，且濃度越大抑制作用越強(qiáng)，作用時(shí)間越長；添加鹽時(shí)，吡蟲啉在前期對(duì)放線菌有促進(jìn)作用，后期低濃度處理的促進(jìn)作用消除。吡蟲啉在鹽脅迫下對(duì)真菌影響不大；在添加鹽和不添加鹽的土壤中，吡蟲啉對(duì)酶活性的影響也不相同。吡蟲啉對(duì)堿性磷酸酶和脲酶有激活作用，添加鹽時(shí)，高濃度的吡蟲啉對(duì)堿性磷酸酶依然有激活作用，而吡蟲啉對(duì)脲酶只有短暫的抑制作用；吡蟲啉對(duì)β－葡萄糖苷酶有抑制作用，而添加鹽時(shí)，吡蟲啉對(duì)其則表現(xiàn)出激活作用；但實(shí)驗(yàn)后期兩種條件下吡蟲啉對(duì)土壤微生物和土壤酶的影響逐漸消失，說明0～10μg／g吡蟲啉對(duì)黃河三角洲地區(qū)棉田土壤環(huán)境是安全的。

［1］ 董合忠，辛承松，李維江，等.山東濱海鹽漬棉田鹽分和養(yǎng)分特征及對(duì)棉花出苗的影響［J］.棉花學(xué)報(bào)，2009，21（4）：290－295.

［2］ 李媛媛，周運(yùn)超，鄒軍，等.黔中石灰?guī)r地區(qū)典型灌木林土壤酶活性與植物物種多樣性研究［J］.水土保持研究，2010，17（3）：245－249.

［3］ 左智天，田昆，向仕敏，等.瀾滄江上游不同土地利用類型土壤氮含量與土壤酶活性研究［J］.水土保持研究，2009，16（4）：280－285.

［4］ 解媛媛，谷潔，高華，等.微生物菌劑酶制劑化肥不同配比對(duì)秸稈還田后土壤酶活性的影響［J］.水土保持研究，2010，17（2）：233－238.

［5］ 荊瑞勇，王麗艷.氯嘧磺隆對(duì)土壤微生物數(shù)量，酶活性及呼吸強(qiáng)度的影響［J］.水土保持研究，2013，20（3）：60－64.

［6］ 劉惠君，鄭巍，劉維屏.新農(nóng)藥吡蟲啉及其代謝產(chǎn)物對(duì)土壤呼吸的影響［J］.環(huán)境科學(xué)，2001，22（4）：73－76.

［7］ 鄭巍，劉惠君，劉維屏.吡蟲啉及代謝產(chǎn)物對(duì)土壤過氧化氫酶活性的影響［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2000，20（6）：524－527.

［8］ Singh J，Singh D K.Dehydrogenase and phosphomonoesterase activities in groundnut（Arachis hypogaea L.）field after diazinon，imidacloprid and lindane treatments［J］.Chemosphere，2005，60（1）：32－42.

［9］ 趙斌，何紹江.微生物學(xué)試驗(yàn)［M］.北京：科學(xué)出版社，2002.

［10］ Tabatabai M A.Soil Enzyme［M］∥Weewer R M，Angle S，Bottomley P，et al.Methods of Soil Analysis，Part2.Microbiological and biochemical properties.Soil Science Society of American，Wisconsin WI，1994.

［11］ 關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1983.

［12］ Wang X C，Lu Q.Activity ofβ－glucosidase in paddy soils in the Taihu Lake Region［J］.Pedosphere，2006，16（1）：118－124.

［13］ 周玲玲，孟亞利，王友華，等.鹽脅迫對(duì)棉田土壤微生物數(shù)量與酶活性的影響［J］.水土保持學(xué)報(bào)，2010，24（2）：241－246.

［14］ 陳為峰，史衍璽.黃河三角洲新生濕地不同植被類型土壤的微生物分布特征［J］.草地學(xué)報(bào)，2010，18（6）：859－864.

［15］ 于群英.土壤磷酸酶活性及其影響因素研究［J］.安徽技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，15（4）：5－8.

［16］ 楊艷菊，王改蘭，張海鵬，等.長期施肥條件下栗褐土堿性磷酸酶活性及其與磷形態(tài)的關(guān)系［J］.土壤，2013，45（4）：678－682.

［17］ 謝勇波，周清明，龔道新.不同化學(xué)農(nóng)藥對(duì)土壤脲酶活性的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：63－65.

［18］ 閆穎.五種農(nóng)藥對(duì)土壤酶活性影響的研究［D］.長春：東北師范大學(xué)，2004.

［19］ Bishnu A，Saha T，Mazumdar D，et al.Assessment of the impact of pesticide residues on microbiological and biochemical parameters of tea garden soils in India［J］.Journal of Environmental Science and Health：Part B，2008，43（8）：723－731.