趙雷 曹富民

近年來以吉非替尼（gefitinib, iressa）和厄洛替尼（erlotinib, tarceva）為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）作為分子靶向藥物已正式應(yīng)用于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的臨床治療，并在一定程度上延長了部分患者的生存期[1]。然而，約60%的NSCLC患者對此類藥物并不敏感，并且?guī)缀跛谐跏紝ζ溆行У幕颊咦罱K都會出現(xiàn)疾病進展，即分別發(fā)生了原發(fā)性及獲得性耐藥[2]。因此，探索EGFRTKI耐藥的機制及克服策略已成為肺癌治療領(lǐng)域的研究熱點。

最近國外有研究[3]認為，EGFR在肺癌中的作用與HSP90密切相關(guān)，抑制HSP90能從多種途徑和環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用，這為解決NSCLC對TKI的耐藥提供了新的思路。但HSP90抑制劑對于EGFR-TKI原發(fā)性及獲得性耐藥的不同NSCLC是否均具有抗腫瘤作用，至今尚未形成統(tǒng)一結(jié)論[4-6]，而國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。本研究將HSP90抑制劑17-DMAG作用于對EGFR-TKI原發(fā)性及獲得性耐藥具有代表性的NSCLC細胞株A549和H1975，觀察它在體外對細胞增殖、凋亡及EGFR蛋白表達的影響，并對其機制進行初步探討，從而為HSP90抑制劑在EGFR-TKI耐藥的NSCLC中的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人NSCLC細胞株A549和H1975分別購自北京協(xié)和細胞資源中心及中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司；17-DMAG購自美國Selleck公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Amresco公司；EGFR抗體購自美國Epitomics公司；HSP90抗體購自美國CST公司；GADPH抗體購自美國Invitrogen公司；全自動酶標儀由奧地利Termo公司生產(chǎn)；流式細胞儀由美國BD公司生產(chǎn)；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)由美國LI-COR公司生產(chǎn)。

1.2 細胞培養(yǎng) A549和H1975細胞均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（內(nèi)含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）置于37oC、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況每2-3天用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測17-DMAG對細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為6×104個/mL，以每孔90 μL的體積接種于96孔細胞培養(yǎng)板，實驗設(shè)正常細胞對照組和不同藥物濃度作用實驗組，每組均設(shè)6個復孔。次日細胞貼壁后，對照組每孔加入10 μL不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，實驗組每孔加入17-DMAG溶液10 μL，使藥物終濃度為0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L、30 μmol/L。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入DMSO溶液150 μL，用全自動酶標儀測定各孔在波長570 nm處的吸光度（optical density, OD）值。按下式計算細胞增殖抑制率：抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，隨機分為對照組和實驗組，細胞貼壁后用PBS緩沖液沖洗，每組細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液4.5 mL，對照組加入不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液0.5 mL，各實驗組加入17-DMAG溶液0.5 mL，使藥物終濃度為0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L。培養(yǎng)48 h后PBS洗滌并用胰酶消化后離心去上清，每組加入70%乙醇溶液3 mL，4oC固定過夜。次日棄去乙醇，PBS離心洗滌兩遍，加入碘化丙啶（PI）染液0.3 mL-0.5 mL重懸細胞后4oC避光染色30 min。每組樣品至少收集106個細胞，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測細胞EGFR及HSP90蛋白表達水平 取對數(shù)生長期細胞，隨機分為對照組和實驗組，各實驗組17-DMAG作用的終濃度為0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L、30 μmol/L。培養(yǎng)48 h后，提取對照組及各實驗組蛋白，根據(jù)BCA法蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度，將蛋白樣品加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量為50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后加入一抗（1：3,000），4oC孵育過夜，加入熒光二抗（1：5,000）37oC避光孵育1 h，應(yīng)用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對目的蛋白條帶圖像進行分析，以EGFR/GADPH和HSP90/GADPH的灰度比值表示A549和H1975細胞中兩種蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析 全部獨立實驗均重復3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Excel 2003作圖。各組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 17-DMAG對A549和H1975細胞的增殖抑制作用 MTT法檢測結(jié)果顯示，以終濃度0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L、30 μmol/L的17-DAMG作用24 h、48 h、72 h后，17-DAMG在不同藥物濃度和不同作用時間對A549和H1975細胞的增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率逐漸增大，呈時間和劑量依賴性（表1）。

2.2 17-DMAG對A549和H1975細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，以終濃度0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L的17-DAMG作用48 h后，17-DMAG對A549和H1975細胞的凋亡率均高于對照組，不同藥物濃度組和對照組之間的凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且凋亡率隨著藥物濃度的增加而逐漸增大，呈劑量依賴性（圖1）。

2.3 17-DMAG對A549和H1975細胞HSP90及EGFR蛋白表達的影響 以終濃度0.003 μmol/L、0.03 μmol/L、0.3 μmol/L、3 μmol/L、30 μmol/L的17-DAMG作用48 h后，A549細胞不同藥物濃度組和對照組之間的HSP90/GADPH及EGFR/GADPH灰度比值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；H1975細胞不同藥物濃度組和對照組之間的HSP90/GADPH灰度比值差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而EGFR/GADPH灰度比值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，17-DMAG對A549和H1975細胞的HSP90及A549細胞的EGFR蛋白表達均無明顯影響，但它能降低H1975細胞的EGFR蛋白表達水平，且隨著藥物濃度的增加逐漸降低（圖2）。

3 討論

NSCLC對EGFR-TKI耐藥的作用機制涉及多種基因水平改變和信號轉(zhuǎn)導通路異常激活。HSP90是廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能分子伴侶，它的“客戶蛋白”大多是腫瘤細胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等重要過程所依賴的蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子或癌基因的產(chǎn)物，包括突變的EGFR、血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor 2, HER2）、survivin、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1, HIF-1α）及細胞周期調(diào)節(jié)因子（CDK4、CDK6）等[7]。抑制HSP90可導致這些“客戶蛋白”通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解，從多種途徑和環(huán)節(jié)產(chǎn)生抗腫瘤作用而實現(xiàn)多靶點攻擊[3]。

表1 17-DAMG在不同濃度和時間對細胞株的增殖抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of 17-DMAG on proliferation of cell lines treated by different concentrations and time

圖2 17-DMAG對細胞株EGFR和HS90蛋白表達的影響。A: A549細胞株；B: H1975細胞株。Fig 2 The effect of 17-DMAG on protein expression of EGFR and HSP90 of cell lines. A: A549 cell line； B: H1975 cell line.

本研究中，A549細胞株為野生型EGFR，同時含有K-ras基因突變。約10%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突變，它是導致EGFR-TKI原發(fā)性耐藥的重要機制。Pao等[8]用TKI治療60例肺腺癌患者時發(fā)現(xiàn)38例不敏感的患者有9例存在K-ras基因突變，Massarelli等[9]認為K-ras突變和EGFR突變相互排斥，是評價NSCLC患者能否接受TKI治療的陰性預測因子。H1975細胞株的EGFR含有L858R和T790M雙突變。L858R為EGFR第21外顯子858位點亮氨酸置換為精氨酸的點突變，是TKI治療的敏感突變。T790M是發(fā)生在EGFR第20外顯子790位密碼子蘇氨酸置換為甲硫氨酸的錯義突變，NSCLC對EGFR-TKI的獲得性耐藥50%以上是由T790M突變造成的[10-12]，它是國際公認的重要獲得性耐藥機制。

我們應(yīng)用體外實驗的方法，將HSP90抑制劑17-DMAG作用于兩種遺傳背景不同的NSCLC細胞株A549和H1975，結(jié)果表明它對兩種細胞均產(chǎn)生了明顯的增殖抑制作用，與Shimamura等[5]的研究結(jié)果相似，而Kobayashi等[6]則認為17-DMAG不能抑制A549細胞增殖，可能與本實驗藥物作用劑量梯度不同有關(guān)。A549細胞的K-ras突變直接持續(xù)激活Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路，并失去對上游EGFR的依賴性，導致TKI耐藥的產(chǎn)生，而H1975細胞依賴EGFR突變后異常激活的多條下游信號轉(zhuǎn)導通路維持生存和增殖，HSP90抑制劑能同時阻斷這些信號通路從而抑制細胞增殖。本研究顯示17-DMAG能促進A549和H1975細胞凋亡，作用48 h后的平均凋亡率分別為11.73%和16.88%，造成總體凋亡率較低的原因可能與細胞狀態(tài)、處理過程及檢測方法等因素有關(guān)。研究表明，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶家族的CDK4和CDK6是HSP90的“客戶蛋白”，抑制HSP90可以降低它們的表達水平，使細胞出現(xiàn)生長周期阻滯并發(fā)生凋亡[13]。Survivin是目前已知最強的凋亡抑制因子，在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài)，抑制HSP90能使它發(fā)生降解，從而促進腫瘤細胞凋亡。這些都可能是17-DMAG作用后細胞發(fā)生凋亡的原因。此外，我們發(fā)現(xiàn)17-DMAG對兩種細胞HSP90的表達均無明顯影響，再次證實它只是發(fā)揮分子伴侶的作用，其本身在藥物作用之后并不會發(fā)生降解。相關(guān)研究[14]認為，HSP90抑制劑可下調(diào)A549細胞先前存在或重新激活的HER2及PI3K/Akt和STAT3/STAT5信號級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達，而與野生型EGFR的存在無關(guān)，這可能是EGFR在17-DMAG作用后未發(fā)生明顯降解的原因。而H1975細胞中突變的EGFR需要HSP90來維持它的構(gòu)象成熟和狀態(tài)穩(wěn)定以保證正常功能的發(fā)揮，所以對于HSP90抑制劑引起的降解效應(yīng)更為敏感。相關(guān)的具體作用機制尚有待于進一步證實。

近年來，HSP90抑制劑作為多靶點的抗腫瘤藥物因其獨特的優(yōu)越性已在各種惡性腫瘤治療方面進行了不同時期的臨床試驗。隨著肺癌的發(fā)病機制不斷闡明，根據(jù)患者的自身情況和基因狀態(tài)設(shè)計合理的用藥方案從而實現(xiàn)真正的個體化治療是未來肺癌臨床研究的前沿和熱點，HSP90抑制劑也將越來越受到人們的關(guān)注并發(fā)揮重要作用。