盛清凱，姜殿文，劉艷艷，竇紅艷，宣玉娟，武 英

(1.山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250100；2.山東省樂陵市畜牧獸醫(yī)局，山東 樂陵 253600；3.山東省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250100)

日糧中納豆芽孢桿菌對(duì)體外豬糞發(fā)酵液中臭氣及微生物的影響

盛清凱1，姜殿文2，劉艷艷3，竇紅艷1，宣玉娟1，武 英1

(1.山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250100；2.山東省樂陵市畜牧獸醫(yī)局，山東 樂陵 253600；3.山東省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南250100)

為了減少舍外糞便污染，研究日糧中納豆芽孢桿菌對(duì)體外豬糞發(fā)酵液中氨氣、硫化氫、糞臭素及菌群的影響。試驗(yàn)組生豬飼喂納豆芽孢桿菌日糧，對(duì)照組無納豆芽孢桿菌。結(jié)果表明，試驗(yàn)組氨氣、硫化氫、色氨酸、吲哚-3-乙酸、糞臭素濃度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，吲哚顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組豬糞發(fā)酵液優(yōu)勢菌以芽孢桿菌(CWBI B1434)為主，含量為26%；試驗(yàn)組以非解乳糖鏈球菌(AF201899)為主，含量為36%，其次為噬淀粉乳酸桿菌，含量為16%。結(jié)果表明納豆芽孢桿菌通過調(diào)整豬糞菌群降低臭味物質(zhì)濃度。為了減少舍外糞便污染，建議豬日糧中添加納豆芽孢桿菌。

豬糞；納豆芽孢桿菌；氨氣；硫化氫；糞臭素

豬糞尿污染已成為嚴(yán)重的社會(huì)公害，引起了人們的廣泛關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)豬糞尿中惡臭物質(zhì)160多種，主要為氨氣、硫化氫以及糞臭素等[1-2]。豬糞尿臭味物質(zhì)來源于動(dòng)物的糞尿。為了減少糞尿污染，人們常在日糧中添加乳酸菌等外源微生物及配制氨基酸平衡日糧等[3]。由于糞尿主要在舍外堆積過程中產(chǎn)生臭味物質(zhì)，污染環(huán)境。受動(dòng)物體內(nèi)外環(huán)境的影響，調(diào)整日糧對(duì)舍外糞便臭味物質(zhì)的產(chǎn)生常常無影響。

納豆芽抱桿菌(BacillusNatto)對(duì)高溫、酸性、膽鹽和人工胃液有一定的耐受能力[4]。日糧中納豆芽孢桿菌可以降低糞尿中氨氣的濃度[5]，但對(duì)舍外糞便中硫化氫、糞臭素及菌群的影響尚不清楚。納豆芽孢桿菌既可以添加到日糧中又可以在發(fā)酵床墊料中消納糞污[6]。本試驗(yàn)旨在研究日糧中的納豆芽孢桿菌對(duì)體外豬糞氨氣、硫化氫、糞臭素及微生物的影響，為舍外糞便污染減排提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

80頭體重為(50.0±0.5)kg的杜長大三元雜交商品豬。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將80頭豬隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10頭豬。兩組分別飼喂基礎(chǔ)日糧及添加0.2%納豆芽孢桿菌的試驗(yàn)日糧，均水泥地面飼養(yǎng)。納豆芽孢桿菌含量為109CFU/g(山東華牧天元農(nóng)牧股份公司提供)。6周后，對(duì)照組和試驗(yàn)組每組每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭豬，將該16頭豬每頭豬的新鮮糞便280 g懸浮在無菌厭氧的礦物質(zhì)介質(zhì)中(每升含NaHCO35.0 g，NaCl 0.9 g，(NH4)2SO40.9 g ，KH2PO40.45 g，K2HPO4.3H2O 0.45 g，CaC12.2H2O 0.03 g，MgCl20.02 g，MnSO4.4H2O 0.01 g，CoCl2.6H2O 0.01 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01 g，半胱氨酸濃度為10% 溶液1.0 mL)。將這種懸浮液隨即轉(zhuǎn)移到無菌充滿CO2的塑料袋中，拍打5 min，后用6層滅菌紗布過濾以除去粗微粒物質(zhì)。將10%(W/V) 糞水厭氧分別分裝于150 mL無菌瓶中，每瓶3個(gè)重復(fù)，每瓶100 mL。38 ℃厭氧下分別培養(yǎng)24 h，然后從各瓶中各取出20 mL溶液，進(jìn)行氨氣、硫化氫、糞臭素及糞臭素相關(guān)指標(biāo)的測定。將對(duì)照組和試驗(yàn)組的豬糞發(fā)酵液各自混勻，液氮冷凍保存，進(jìn)行菌群分析。

1.3 臭味物質(zhì)的測定

氨采用納氏比色法測定；硫化氫采用碘量法測定；色氨酸、吲哚、吲哚-3-乙酸、糞臭素采用HPLC法[7]進(jìn)行測定。

1.4 豬糞發(fā)酵液中菌群分析

提取DNA利用通用引物V3-340F、V3-532R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，利用熒光標(biāo)記單鏈構(gòu)象多態(tài)性及片段長度多態(tài)性(F-SSCP-FLP)技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后3730xl全自動(dòng)分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離[8]，NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，確定發(fā)酵液中優(yōu)勢菌群的種類、含量及同源性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS(V9.1) 軟件GLM(general linear models) 程序?qū)λ袛?shù)據(jù)進(jìn)行處理,對(duì)照組和試驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.01 為差異極顯著,P<0.05 為差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌對(duì)豬糞臭味物質(zhì)的影響

試驗(yàn)組中氨氣、硫化氫、色氨酸、吲哚-3-乙酸及糞臭素濃度極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，吲哚濃度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，表明試驗(yàn)日糧中的納豆芽孢桿菌可以減少豬糞發(fā)酵液中氨氣、硫化氫及糞臭素的濃度(表1)。

2.2 發(fā)酵液優(yōu)勢菌群

對(duì)照組中優(yōu)勢菌為芽孢桿菌(CWBIB1434)，含量為26%。試驗(yàn)組中優(yōu)勢菌為非解乳糖鏈球菌(AF201899)，含量為36%；其次為噬淀粉乳桿菌。試驗(yàn)組中多檢出芽孢桿菌(MA001)、噬淀粉乳酸桿菌。對(duì)照組和試驗(yàn)組優(yōu)勢菌種類及組成不同，表明發(fā)酵液中的菌群受日糧納豆芽孢桿菌影響(表2)。

2.3 豬糞發(fā)酵液微生物同源性分析

圖1和圖2 相比，檢出條帶明顯增多。圖1 中芽孢桿菌CWBI B1434(C31-1-B11)與乳酸菌(C31-1-B1)同源性為31%。賴氨酸芽孢桿菌G10(C3/1-1-B2)與芽孢桿菌(B308-C31-1H7)同源性為100%。圖2中增加了圖1中未能培養(yǎng)的鏈球菌(T33147 V3R.)及未能培養(yǎng)的梭菌(T331E11V3R)。

表1 不同臭味物質(zhì)的變化Table 1 Change of different odours in pig fermentation broths mg/L

注：同列肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩注大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes: Values with different lowercase superscripts mean significant difference(P<0.05),different uppercase superscripts mean extreme difference(P<0.01).

表2 發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌群Table 2 Dominant bacteria in fermentation broths

3 討 論

養(yǎng)豬過程中產(chǎn)生的氨氣、硫化氫、糞臭素等惡臭物質(zhì)不僅嚴(yán)重影響了豬的生長發(fā)育，也使豬場附近居民受到危害?？諝庵械陌睔馕廴臼撬嵊晷纬傻闹匾蛑?，而畜禽生產(chǎn)已經(jīng)成為全球最大的氨氣污染來源。益生菌作為一種無毒、無殘留、無抗藥性的飼料添加劑，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、降低排泄物氨氣散發(fā)量等諸多功能。為了改善養(yǎng)殖環(huán)境，日糧中常添加益生菌。納豆芽孢桿菌作為一種益生菌，可添加于豬日糧中[9]，也可作為一種發(fā)酵床菌種使用[6]，減少氨的產(chǎn)生。本文中納豆芽孢桿菌降低了豬糞發(fā)酵液氨氣濃度，與楊鋒[5]試驗(yàn)結(jié)果相似。氨的降低可能與納豆芽孢桿菌分泌蛋白酶[10]及噬淀粉乳桿菌等菌群[11]改變相關(guān)。蛋白酶降解蛋白質(zhì)，有利于氨的轉(zhuǎn)化。噬淀粉乳桿菌在腸道分泌淀粉酶[12]、植酸酶[13]，也有利于氨的轉(zhuǎn)化[14]。

圖1 對(duì)照組豬糞發(fā)酵液微生物相似性分析Fig.1 Microbial similarity in control group pig manure fermentation broths

圖2 試驗(yàn)組豬糞發(fā)酵液微生物相似性分析Fig.2 Microbial similarity in test group pig manure fermentation broths

本試驗(yàn)納豆芽孢桿菌降低豬糞發(fā)酵液產(chǎn)硫化氫濃度，結(jié)論與Lee等[15-16]相似。納豆芽孢桿菌降低硫化氫含量的機(jī)理可能在于芽孢桿菌群(M001)。Yumoto 等報(bào)道芽孢桿菌(M001)分泌物具有過氧化氫酶、氧化酶的活性，可以減少硫化氫的產(chǎn)生[17]。

本試驗(yàn)中試驗(yàn)組飼料添加芽孢桿菌，降低了豬糞發(fā)酵液中糞臭素的濃度，與色氨酸轉(zhuǎn)化途徑中微生物的改變影響糞臭素的形成[18-19]一致，差異之處可能在于影響的微生物菌不同。本試驗(yàn)中豬糞發(fā)酵液的優(yōu)勢菌為非解乳糖鏈球菌(AF201899)和噬淀粉乳桿菌。豬腸道中參與色氨酸轉(zhuǎn)化成糞臭素的菌尚不完全清楚。目前報(bào)道的豬腸道中參與糞臭素降解的菌為：乳酸菌(11201)[20]、梭菌(drakeiiandskatologenesis[21]、disporicum[22]、ATCC 25775[23])。關(guān)于非解乳糖鏈球菌(AF201899)的功能，目前尚未見報(bào)道。Rinkinen 等[24]報(bào)道非解乳糖鏈球菌為狗空腸和糞便中產(chǎn)乳酸的優(yōu)勢菌，Vandanme等[25]報(bào)道非解乳糖鏈球菌分泌物具有β-糖苷酶、α-牛乳糖苷酶、淀粉酶、脲酶的活性，酸性物質(zhì)來源于半乳糖、牛乳糖等物質(zhì)。日糧中的乳酸可降低腸道中糞臭素的含量[26-27]。噬淀粉乳桿菌為一種有益菌[28]，分泌乳酸及淀粉酶[12]，在豬結(jié)腸中在半乳低聚糖和雙歧桿菌的作用下促進(jìn)生長[29]。目前尚未見噬淀粉乳桿菌直接降解糞臭素的報(bào)道。糞臭素在體外可被鏈球菌6020[30]及乳酸菌1.12[31]降解。本試驗(yàn)中非解乳糖鏈球菌(AF201899)、噬淀粉乳酸桿菌及芽孢桿菌(M001)的功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

日糧中的納豆芽孢桿菌通過影響豬糞發(fā)酵液中的菌群降低豬糞氨氣、硫化氫及糞臭素的濃度。日糧中添加納豆芽孢桿菌，有益于體外豬糞臭氣的減少。

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EffectofBacillusNattoinDietonOdorsandMicrobesinPigManureFermentationBrothsinVitro

SHENG Qing-kai1,JIANG Dian-wen2,LIU Yan-yan3,DOU Hong-yan1,XUAN Yu-juan1,WU Ying1

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicineofSAAS/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan，Shandong250100,China；2.LaolingCityBureauofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Laoling,Shandong253600,China;3.BiotechnologyResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan，Shandong250100,China)

In order to reduce the pollution of pig manure outdoors,the study investigated the effect ofBacillusnattoin diet on ammonia,hydrogen sulfide,skatole and microbes in pig manure fermentation broths.The test group pigs intook diet with additionalBacillusnattoAnd the liquid manures were anaerobic fermented.When compared to the control group,contents of ammonia,hydrogen sulfide,Tryp,indole -3- acetic acid and skatole in test group lowered(P<0.01) and indole decreased(P<0.05).The Bacillus sp(CWBI B1434) was the predominate bacteria in control group with a content of 26%,the lactose Streptococcus(AF201899) predominated in the test group with a content of 36% andLactobacillusamylovorus16% secondly.The results showed thatBacillusnatto reduced odor contents by influencing the pig manure microbes.Supplementation ofBacillusnattoin diet was beneficial to reduce the pollution of pig manure outdoors.

pig manure；Bacillusnatto；ammonia；hydrogen sulfide；skatole

2014-04-16，

2014-06-17

國家自然基金(31172245)

盛清凱(1971-)，男，山東陵縣人，博士，研究員，研究方向?yàn)閱挝竸?dòng)物營養(yǎng)與環(huán)境科學(xué)。E-mail：qksheng@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)10-0036-05