鄭偉 牛立健 朱超 宋思新 侯大鵬 謝方民 張春普 曹春光

·實驗研究·

安宮牛黃丸對大鼠缺血性腦損傷后HSP70表達的影響

鄭偉 牛立健 朱超 宋思新 侯大鵬 謝方民 張春普 曹春光

目的 研究安宮牛黃丸對大鼠缺血性腦損傷的影響及機制。方法 60只研究用大鼠進行隨機分組, 分為安宮牛黃丸治療組(30只)和缺血對照組(30只), 再將兩組各分為24、48、72 h三個亞組 。構(gòu)建大鼠局部腦缺血模型, 缺血對照組給予等量生理鹽水灌服, 而治療組給予安宮牛黃丸, 1丸/次, 1次/d, 灌服, 直至到各亞組的觀測時間點。然后對缺血區(qū)腦組織進行病理形態(tài)學分析, 并用免疫組化S-P的方法對半暗帶熱休克蛋白(HSP)70進行檢測。結(jié)果 使用安宮牛黃丸的大鼠個亞組HSP70的表達顯著高于使用生理鹽水的對照組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且安宮牛黃丸治療組的大鼠病理形態(tài)改變較缺血對照組明顯, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 HSP70是調(diào)節(jié)腦損傷中重要的內(nèi)源性保護因子, 安宮牛黃丸可通過調(diào)節(jié)HSP70的表達進而起到保護缺血性腦組織的作用。

安宮牛黃丸；缺血性腦損傷；大鼠；熱休克蛋白

隨著當今社會的發(fā)展, 人們物質(zhì)生活水平的提高, 生活壓力的增加, 使得腦血管疾病(腦血栓形成、腦栓塞、腦出血等)的發(fā)病率不斷增加, 西藥被廣泛引用治療腦血管疾病,其見效快, 但其副作用較大, 從中醫(yī)角度講, 西藥只治標不治本, 現(xiàn)在許多研究者把對治療腦血管疾病的藥物研究重點轉(zhuǎn)移到中藥上, 目前有許多中藥對缺血性腦病有明顯作用,其作用機制目前不是很明確。熱休克蛋白(HSP)70是一種內(nèi)源性保護因子, 具有促進細胞內(nèi)糖異生和糖原合成的作用,從而提高應(yīng)激能力, 保護細胞的功能結(jié)構(gòu)。本文章主要研究安宮牛黃丸對缺血性腦損傷的保護作用, 并探討HSP70基因表達的變化及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選用健康的大鼠60只, 體重200～300 g。隨機分為安宮牛黃丸(選用北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥)治療組(30只)和缺血對照組(30只), 再將兩組各分為24、48、72 h三個亞組 。構(gòu)建大鼠局部腦缺血模型, 缺血對照組給予等量生理鹽水灌服, 而治療組給予安宮牛黃丸1丸/次, 1次/d, 灌服, 每個點10只大鼠, 直至到各亞組的觀測時間點,最后進行相應(yīng)的比較。

1.2 方法 采用線栓法制作大腦中動脈(MCA)局部缺血模型［1］。大鼠用10%的水合氯醛(400 mg/kg進行腹腔注射麻醉,將其腦部固定于手術(shù)臺, 頸部正中切口, 分離甲狀腺, 用無菌紗布保護, 然后分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA), 并在ICA、ECA分叉處結(jié)扎ECA, 在右側(cè)CCA出剪一V字形切口, 插入0.28 mm的尼龍線, 線長約18～22 mm, 將栓線插入到MCA起始處, 感覺有輕微阻力時停止插線, 并向外拉出一點即可實現(xiàn)阻塞MCA所有的血液來源,然后將CCA連同尼龍線一起結(jié)扎, 甲狀腺復位, 關(guān)閉并縫合切口。切口局部給予甲硝唑沖洗消毒, 給予慶大霉素預(yù)防感染。術(shù)中體溫用烤燈維持在37.5℃左右, 分籠飼養(yǎng), 給予飼料喂養(yǎng)。入選標準:左前肢屈曲內(nèi)收；爬行時左側(cè)旋轉(zhuǎn)；站立時向左側(cè)傾斜, 符合上述標準的表明栓堵成功, 其余則失敗。

1.3 觀測指標和測評方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 參見Longa等5分制評分標準：0分, 無神經(jīng)功能缺損；1分, 輕度神經(jīng)功能缺損(前肢不能完全屈曲內(nèi)收)；2分, 中度神經(jīng)功能缺損(向患者轉(zhuǎn)圈)；3分,嚴重神經(jīng)功能缺損(向患側(cè)傾斜)；4分, 昏迷、意識不清。

1.3.2 HSP70測定 首先制作細胞切片, 然后光鏡下觀察染色結(jié)果, 并按照免疫組化S-P的方法進行半定量分析［2］。采用病理圖像分析儀隨機選10個高倍鏡非重疊視野記錄陽性細胞數(shù)。

1.3.3 血清白細胞介素-10(IL-10)含量測定 大鼠在斷頭處死前提取血清, 備用, 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-10的含量。1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù), 計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)形式表示, 實施t檢驗；計數(shù)資料以率(%)形式表示, 實施χ2檢驗, P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 通過對神經(jīng)功能評分的測定來看, 安宮牛黃丸治療組可明顯降低神經(jīng)功能行為的評分, 較治療前和缺血對照組存在顯著性改變, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同時間點神經(jīng)功能的評分( x-±s, 分)

2.2 HSP70 免疫組化測定在大鼠腦組織中可見HSP70的表達, 治療組HSP70的細胞數(shù)明顯高于對照組, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 各亞組HSP70細胞計數(shù)與缺血對照組之間有明顯差異。結(jié)果詳見表2。

表2 各亞組HSP70細胞計數(shù)( x-±s)

2.3 兩組對大鼠缺血性腦損傷血清IL-10的影響 與缺血對照組相比較, 安宮牛黃丸治療組的血清IL-10含量明顯升高, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組血清IL-10的含量( x-±s)

3 討論

缺血性腦損傷各種原因?qū)е碌哪X部血液供應(yīng)障礙, 出現(xiàn)組織缺血、缺氧性壞死, 出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損, 發(fā)病率、致殘率和死亡率均較高, 是人類的三大致死疾病之一。因此, 對該疾病的預(yù)防和治療成為醫(yī)學界研究的重中之重。如今, 許多醫(yī)學者將對缺血性腦損傷的治療研究轉(zhuǎn)移到中醫(yī)中藥上［4］。中醫(yī)上的缺血性腦病屬于中風病其中一種, 對其中醫(yī)治法有很多種, 如祛風化痰、活血通絡(luò)、平肝潛陽、溫腎開竅、回陽救陰等。本文章談到的安宮牛黃丸出自吳鞠通的《溫病條辨》, 由12味中藥組成, 主要功用為清熱開竅、解毒, 抗驚厥, 降壓, 保護肝臟和大腦, 增加腦部血流, 研究表明安宮牛黃丸對缺血性腦損傷有保護性作用［3］。

熱休克蛋白(HSP)70是一種應(yīng)激蛋白, 是機體細胞在一些理化因素刺激后高效表達的一種蛋白質(zhì)［4］。HSP70是一種保護性蛋白, 當機體受到各種惡劣環(huán)境影響時, 就會被大量釋放出來, 從而維持細胞的正常生理活動, 阻止影響機體健康的蛋白質(zhì)之間的相互作用, 從而增強機體的抵抗力, 起到保護性作用。隨著醫(yī)學界對熱休克蛋白研究的不斷深入, 該蛋白質(zhì)在醫(yī)學和生物工程等方面的前景十分廣闊。本研究中的安宮牛黃丸通過作用于機體, 促進機體合成更多的HSP70,提高機體抵抗力, 增強腦組織的修復力, 對腦組織起到保護性作用。

［1］ 劉宗濤, 沙地克·沙吾提, 李繼彬, 等.安宮牛黃丸對實驗性大鼠腦缺血的保護作用.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2011, 9(9):710-712.

［2］ 殷妮娜.安宮牛黃丸對大鼠腦出血后TNF-α表達的影響.咸寧學院學報, 2011,33(10):12-15.

［3］ 王冰, 王宗仁, 王洪典, 等.芪丹通脈片對大鼠海馬局部缺血及HSP70蛋白表達的影響.第四軍醫(yī)大學學報, 2006(5):27.

［4］ 趙考考, 崔毓桂, 劉嘉茵.熱休克蛋白10的研究進展.醫(yī)學綜述, 2011, 17(1):1-3.

2014-04-08］

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(項目編號：2013-253)

271000 泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科