王金福，張永霞，顧劍新，王彤光，孫維平，曹彩琴

(上海農林職業(yè)技術學院,上海 201600)

復方中藥體外抗豬衣原體活性研究

王金福，張永霞，顧劍新，王彤光，孫維平，曹彩琴

(上海農林職業(yè)技術學院,上海 201600)

應用微量Vero細胞培養(yǎng)法，檢測復方中藥的體外抗衣原體活性，為防治豬衣原體病提供依據(jù)。結果表明，復方中藥的MIC值是39.06 mg/mL，隨著中藥濃度升高，包涵體的體積縮小、數(shù)量減少，直至消失，對照組未見中藥對Vero細胞有毒性作用。試驗結果顯示，復方中藥體外對豬衣原體有抗菌活性。

復方中藥；衣原體；抗菌活性

豬衣原體病是由鸚鵡熱衣原體感染引起的一種人、獸、禽類共患的接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙，公豬睪丸炎，仔豬肺炎、腸炎及多發(fā)性關節(jié)炎等癥狀，持續(xù)潛伏傳染為豬衣原體病的主要流行病學特征[1]。不同年齡、不同品種的豬均易感染，一般以懷孕母豬和仔豬多發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的損失[2]。人的醫(yī)學臨床研究上有報道部分清熱中藥方劑對衣原體有比較好的治療效果[3]，但在養(yǎng)豬業(yè)上是否具有抗衣原體活性仍不清楚。本試驗用微量Vero細胞培養(yǎng)法，對由柴胡、黃連、魚腥草、大青葉、當歸等中藥組成的復方制劑在體外抗豬衣原體的活性研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗用中藥 柴胡、黃連、魚腥草、大青葉、當歸等中藥原料均購自上海余天成醫(yī)藥有限公司，按常規(guī)水提法進行中藥有效成分的提取，即先用蒸餾水按10∶1的比例浸泡1 h，大火燒開煮沸后換文火維持30 min，收集濾液，向殘渣中再加蒸餾水煮沸30 min，過濾，將2次濾液合并。蒸發(fā)濃縮成1 g/mL 的水煎劑，調pH 7.2～7.4，2 500 rmp/min離心10 min，過濾，將濾液分裝成5 mL/瓶的規(guī)格，高壓滅菌消毒后放4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 豬衣原體菌株 豬衣原體菌株為從松江一家庭農場的豬只中分離得到的，經SPF雞胚中傳6代，Vero細胞傳3代，能在Vero細胞上形成穩(wěn)定的包涵體的菌株。

1.1.3 單層Vero細胞的制備 Vero細胞用1640培養(yǎng)液培養(yǎng)(含10%乳牛血清)培養(yǎng)，取200 μlVero細胞懸液滴入96孔微量細胞培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞長成致密單層后備用。

1.2 方 法

1.2.1 衣原體接種 取生長合格的Vero細胞，棄去培養(yǎng)液，用pH7.2的Hanks液輕洗細胞2次，按原培養(yǎng)液的10%加入衣原體接種液，37 ℃吸附2 h后棄去，每孔加入100 μL含放線菌酮(2 μg/mL)的衣原體分離培養(yǎng)液待用[4]。

1.2.2 復方中藥制劑抗衣原體活性試驗 試驗共設計3組：第一組是不含中藥的衣原體陽性對照組、第二組是不含衣原體中藥對照組、第三組是中藥與衣原體作用組，每組做8個重復。中藥組是將1 g/mL中藥用Hanks液倍比稀釋成系列濃度后，分別取100 μL加入到接種好的Vero細胞的微量培養(yǎng)板，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)120 h后棄去培養(yǎng)液，用95%乙醇固5 min后，姬姆薩染色鏡檢觀察胞漿內是否有包涵體形成。

1.2.3 結果判斷 染色后在光鏡下鏡檢，在無中藥陽性對照組中每孔均能看到衣原體包涵體，不加衣原體中藥陰性對照組細胞生長良好的條件下，再看中藥組的試驗結果。光鏡下未見到包涵體的最低濃度為該中藥的最小抑菌濃度( MIC)。

2 結 果

衣原體經Vero細胞培養(yǎng)120 h后，抗衣原體活性檢測結果表明：中藥組具有抗衣原體作用，具體見表1。在光鏡下觀察到隨著中藥濃度升高，包涵體的體積縮小、數(shù)量減少，直至消失。而陽性對照則每孔均有包涵體出現(xiàn)，試驗中未發(fā)現(xiàn)中藥制劑對Vero細胞的生長有影響。

表1 復方中藥制劑體外抗衣原體活性(MIC)Table 1 Anti-chlamydial activity of compound Chinese medicine in vitro(MIC)

備注：“-”代表無包涵體，“+”代表有包涵體。

Notes：“-”means no inclusion;“+”means inclusion.

3 小 結

在動物臨床上可用于治療豬衣原體病的藥物種類相對較少，加之耐藥性問題在動物臨床日益嚴峻，導致抗菌藥物的使用受限[5]。選擇中藥制劑來治療豬衣原體病是一個方向，盡管中藥制劑在豬衣原體治療上尚不夠成熟，但通過體外抗豬衣原體活性實驗，將為篩選有效中藥和研究其作用機理提供理論依據(jù)。

本研究表明，試驗所設計的中藥復方制劑具有體外抗豬衣原體活性，而且未發(fā)現(xiàn)對Vero細胞生長有影響，說明應用Vero細胞培養(yǎng)法檢測復方中藥制劑的體外抗豬衣原體活性是可行的。這為獸醫(yī)臨床篩選具有抗豬衣原體活性的中藥制劑提供了一個有效的手段和途徑。

[1]邱昌慶,程淑敏,周繼章,等.規(guī)?；i場豬衣原體病的檢測[J].中國獸醫(yī)雜志,2000,26(3):23-24.

[2]白挨泉,馮國金.廣東部分地區(qū)豬衣原體病的血清學調查[J].中國畜牧獸醫(yī),2004,31(12):37-39.

[3]李建軍,涂裕英,佟 菊.泌尿生殖道沙眼衣原體清熱中藥的藥敏試驗[J].中國性病艾滋病防治,2001,7(1):31-32.

[4]Hinton D G,Shipley A,Galvin J.W,et al.Chlamydiosis in workers at a duck farm and processing plant[J].Austrlian Veterinary Journal,1993,70 (5):174-176.

[5]Nagy B,Fekete P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals[J].Veterinary Research,1999,30 (223):259-284.

StudyonAnti-swineChlamydiaActivityofCompoundTraditionalChineseMedicineinVitro

WANG Jin-fu,ZHANG Yong-xia,GU Jian-xin,WANG Tong-guang,SUN Wei-ping,CAO Cai-qin

(ShanghaiVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Shanghai201600,China)

Micro-scale Vero cell culture method was employed to detect the anti-Chlamydia activity of compound traditional Chinese medicine so as to hopefully provide prescription reference for veterinary clinic treatment.The results showed that the MIC value of compound Chinese medicine was 39.06 mg/mL.And as the concentration of Chinese medicine rose,the size and number of inclusion bodies reduced and decreased till it totally disappeared.In the control group,no toxic effect of traditional Chinese medicine on Vero cells was observed.According to the experiment results,compound traditional Chinese medicine had anti-swine Chlamydia activity in vitro.

compound traditional Chinese medicine; chlamydia; antibacterial activity

2013-10-17，

2013-12-03

上海農林職業(yè)技術學院科研資助項目(091024)

王金福(1977-)，男，河南民權人，碩士，副教授，主要從事動物臨床疾病的診療與教學工作。E-mail:wjf3027@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0070-02