吳小霞 李興暖 周裔春

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西九江 332000)

仿生酶解法制備抗凝活性土鱉蟲工藝研究*

吳小霞 李興暖 周裔春

(九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 江西九江 332000)

目的研究仿生酶解法水解土鱉蟲的條件。方法以APTT和PT為指標(biāo)，單因素考察仿生酶解法制備土鱉蟲的工藝條件。結(jié)果土鱉蟲酶解條件為：土鱉蟲先用37℃人工胃液加入4%(酶底比)胃蛋白酶水解4h，再于人工腸液中加入4%胰蛋白酶水解3h。結(jié)論仿生酶解法適于提取具有抗凝活性的土鱉蟲。

土鱉蟲，仿生酶解法，抗凝活性

土鱉蟲(Eupolyphage sinensis Walker )， 又名土元，屬節(jié)肢動物門昆蟲綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲，為《中華人民共和國藥典》記載的正品藥材，是傳統(tǒng)的活血化瘀類動物藥。祖國醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載和豐富的臨床實踐均已證明其具有破血逐瘀、續(xù)筋接骨、消炎散結(jié)和舒經(jīng)活血等重要藥用功效[1]?，F(xiàn)代藥理試驗也充分證明土鱉蟲具有溶解靜脈血栓，抑制血小板聚集、抗凝血和抗癌等藥效[1]。

土鱉蟲體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)，前期研究證實動物灌胃給予土鱉蟲纖溶活性蛋白后凝血時間明顯延長，已知蛋白質(zhì)經(jīng)胃腸道消化酶的消化作用后吸收進(jìn)入體內(nèi)可發(fā)揮作用。土鱉蟲纖溶活性蛋白的抗凝血作用很可能是消化酶水解產(chǎn)物發(fā)揮的作用。因此本實驗?zāi)M胃和小腸的環(huán)境及消化過程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶仿生制備土鱉蟲多肽[2]，以明確土鱉蟲蛋白入血后發(fā)揮抗凝血作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。同時摸索土鱉蟲仿生酶解的最佳工藝，為獲得高活性、高得率的土鱉蟲多肽和有效利用土鱉蟲提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

土鱉蟲干燥體(購自九江市開心人大藥房，經(jīng)九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院高春華教授鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis Walker 的雌蟲)，APTT、PT試劑(上海太陽生物試劑公司)，胃蛋白酶、胰蛋白酶(Sigma公司)，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1仿生酶解工藝 該工藝流程參照文獻(xiàn)[2]略有改動，取土鱉蟲干燥體打粉，過40目篩。稱取土鱉蟲藥材細(xì)粉1g于50mL錐形瓶中，加人工胃液( 固液比1∶20)密閉。于37℃恒溫水浴作用30min后，按一定量的酶底比加入胃蛋白酶，水解一定時間[3]，然后調(diào)節(jié)胃蛋白酶酶解液pH至7.0，加入人工腸液20mL ，密閉。于37℃恒溫水浴作用30min后，按一定量的酶底比加入胰蛋白酶水解一定時間，然后將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15min。將各酶解液置于85℃ 恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以5 000rpm離心10min[3]，取上清液。

1.2.2酶解產(chǎn)物的抗凝作用實驗 取健康家兔耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉后，心臟取血，加入3.8% 枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，混勻后以3 000rpm離心15min，取上清液，分離出貧血小板血漿(PPP)[4]。

取PPP 100μL于測試杯中，加酶解液10μL，37℃，預(yù)溫3min，加入APTT或PT 試劑200μL (預(yù)溫3min)[4]，開始計時，至有纖維蛋白絲出現(xiàn)，準(zhǔn)確記錄凝固時間，以生理鹽水和未酶解土鱉蟲為對照。

2 實驗結(jié)果

2.1胃蛋白酶酶底比考察

隨酶底比增大，水解程度逐漸增大，APTT和PT時間也逐漸延長，且均與未酶解和生理鹽水組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表1(p<0.01)。但酶底比為4%和5%的數(shù)值差異不大，從節(jié)約的角度考慮以4%酶底比為最佳。

表1 胃蛋白酶酶底比考察結(jié)果

2.2胃蛋白酶酶解時間

隨酶解時間的延長，水解度逐漸增大，APTT和PT時間也逐漸延長，且均與未酶解和生理鹽水組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2(p<0.01)。但4h和5h的水解度和抗凝效果變化趨于平坦，為節(jié)約成本選用4h。

表2 胃蛋白酶酶解時間考察結(jié)果

2.3胰蛋白酶酶底比

在最佳胃蛋白酶水解條件水解后，模擬體內(nèi)水解情況再進(jìn)行胰蛋白酶水解。表3顯示，隨酶底比增大，水解程度逐漸增大，APTT和PT時間也逐漸延長，且均與未酶解和生理鹽水組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表3(p<0.01)，雖然水解度一直呈上升趨勢，但酶底比為4%和5%的APTT和PT數(shù)值差異不大，從抗凝效果考慮，選用4%的酶底比。

表3 胰蛋白酶酶底比考察結(jié)果

2.4胰蛋白酶酶解時間

隨酶解時間的延長，水解度逐漸增大，APTT和PT時間也逐漸延長，且均與未酶解和生理鹽水組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表4(p<0.01)，但從3h后的水解度和抗凝效果變化趨于平坦，為節(jié)約成本選用3h。

表4 胰蛋白酶酶解時間考察結(jié)果

綜上所述，從抗凝效果來看，隨水解時間和酶底比的增大，水解度增大的同時抗凝效果也在增大，但從成本方面考慮，選用胃蛋白酶酶底比為4%、水解4h，胰蛋白酶酶底比為4%、水解3h。

3 討論

土鱉蟲為中藥臨床常用的動物藥，其主要成分為蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)為大分子物質(zhì)，只有經(jīng)胃腸道消化水解成肽和其它小分子物質(zhì)后方可被吸收入血發(fā)揮作用。因此本實驗?zāi)M體內(nèi)胃腸道的環(huán)境[2]，依次經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行仿生酶解制備土鱉蟲水解產(chǎn)物，以抗凝活性為指標(biāo)摸索兩酶的最佳水解條件。實驗結(jié)果表明，土鱉蟲仿生酶解法獲得的土鱉蟲水解產(chǎn)物能明顯的延長APTT和PT作用時間。凝血是由一系列凝血因子相繼酶解激活的過程，包括內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和外源性凝血系統(tǒng)兩條途徑。APTT和PT分別反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和外源性凝血系統(tǒng)的活性[5]，說明土鱉蟲水解產(chǎn)物可能是通過內(nèi)源性凝血途徑或外源性凝血途徑達(dá)到抗凝效果的。

目前土鱉蟲多以全粉末直接入藥，存在著用藥劑量大、易造成微生物污染、可致過敏反應(yīng)、急性肝腎功能損害、溶血反應(yīng)、中樞抑制和致畸等毒副作用潛在的危險性[2]。而關(guān)于土鱉蟲抗凝血作用的藥效基礎(chǔ)和入血成分還不甚明了。本研究為進(jìn)一步研究土鱉蟲抗凝活性成分奠定了實驗基礎(chǔ)。

[1]嚴(yán)夢思，李興暖，趙勇，等. 土鱉蟲多肽對正常和免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2012，23(8)：1940.

[2]黃能聽，王玉蓉，許文博，等. 仿生酶解法提取蜈蚣的工藝研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2009，51(10)：706.

[3]許文博. 全蝎抗凝活性部位的分離分析及酶解動力學(xué)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[4]黃鎮(zhèn)林，曹唯儀，何亮穎，等. 仿生酶解法提取土鱉蟲的工藝研究[J]. 中醫(yī)藥信息， 2013，31(2)：20.

[5]李興暖. 地鱉蟲纖溶活性蛋白抗血栓、抗腫瘤及其基因克隆與表達(dá)的研究[D].汕頭：汕頭大學(xué)，2007.

(責(zé)任編輯胡安娜)

On Bionic Enzymatic Method for Extration of Anticoagulant Activity Eupolyphage Sinensis Walker

WU Xiaoxia， LI Xingnuan， ZHOU Yichun

(School of Basic Medicine of Jiujiang University,Jiujiang,Jiangxi 332005， China)

ObjectiveTo study the condition of bionic enzymatic method of extracting Eupolyphage Sinensis Walker .MethodThe condition of bionic enzymatic method of extracting Eupolyphage Sinensis Walker was observed by single factor observation taken the active partial thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (PT).ResultThe best enzymatic hydrolysis condition was as follows: Eupolyphage Sinensis Walker was in artificialgastric juice (37℃) and pepsin (ratio of pepsin to substratewas4% ) for 4 hours， and then was hydrolyzed in artificial intestinal juice (37℃) for 4 hours and trypsin (ratio of pepsin to substrate was 4% ) for 3 hours.ConclusionThe bionic enzymatic method could be used in the extraction of anticoagulant activity Eupolyphage Sinensis Walker

Eupolyphage Sinensis Walker， bionic enzymatic technique， anticoagulant activity

江西省衛(wèi)生廳科技計劃資助項目( 20092078)，九江學(xué)院大學(xué)生自主創(chuàng)新性實驗項目(11XSCXXSY31)

2014-5-1

吳小霞，li_xingnuan@126.com。

R 282

A

1674-9545(2014)03-0075-(03)