陳學(xué)珍

(山東省墾利縣人民醫(yī)院 兒科, 山東 墾利, 257500)

哮喘是臨床常見病、多發(fā)病，是兒童中最常見的慢性呼吸道疾病。哮喘的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等因素共同作用的影響，發(fā)病呈現(xiàn)多因性和異質(zhì)性，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜[1]。目前公認(rèn)哮喘是一種具有明顯家族聚集傾向的復(fù)雜的多因素、多基因遺傳病[2]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為第三代多態(tài)性標(biāo)志，是目前研究基因組多樣性、識(shí)別和定位復(fù)雜疾病相關(guān)基因的常用檢測(cè)標(biāo)志[3]。本研究通過對(duì)東營(yíng)地區(qū)哮喘兒童4個(gè)常見哮喘相關(guān)基因，即ACE I/D、ADRB2 Arg16Gly、MS4A2 Glu237Gly、TNF-α G-308A的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并與健康兒童進(jìn)行對(duì)比，探討其對(duì)兒童哮喘早期防治的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月—2014年3月本院兒科收治的哮喘患兒46例，設(shè)為觀察組，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中關(guān)于哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，均能順利完成相關(guān)肺功能檢查，排除患有慢性消耗性疾病、慢性咳嗽、免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心肝腎功能異常及腫瘤者。其中男28例，女18例；年齡1～7歲，平均年齡(3.7±1.8)歲；其中有家族喘息史患兒4例；既往有喘息史患兒36例；有濕疹治療史患兒4例。并選擇同期無血緣關(guān)系的52例健康體檢兒童作為對(duì)照組，均無自身及家族特異性病史，其中男34例，女18例，年齡1～9歲，平均(3.9±2.1)歲。2組兒童性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有兒童均為山東東營(yíng)區(qū)人，漢族。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兒童的家長(zhǎng)均知情同意。

1.2 方法

專用無菌毛刷采集兒童的口腔黏膜細(xì)胞，進(jìn)行DNA提取，放入固定藥液，外送上海楓林醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，采用DNA測(cè)序技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)ACE I/D、ADRB2 Arg16Gly、MS4A2 Glu237Gly、TNF-α G-308A這4種哮喘相關(guān)基因位點(diǎn)的SNP進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ACE基因檢測(cè)結(jié)果

觀察組兒童ACE基因I/D多態(tài)性中, DD基因發(fā)生頻次顯著高于對(duì)照組(P<0.05), D等位基因的發(fā)生頻次顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組與對(duì)照組比較，DD型基因與ID、Ⅱ型基因的優(yōu)勢(shì)比(OR)為OR(DD/ID)=3.50, 95%CI=1.67～5.36, OR(DD/II)=6.67, 95%CI=1.35～8.42, D基因與I基因的優(yōu)勢(shì)比為OR(D/I)=2.56, 95%CI=1.12～4.67。見表1。

表1 2組兒童ACE基因型及等位基因頻次比較[n(%)]

2.2 ADRB2、MS4A2、TNF-α基因檢測(cè)結(jié)果

2組兒童ADRB2基因Arg16Gly多態(tài)性中, GG基因發(fā)生頻次顯著高于對(duì)照組(P<0.05), G等位基因的發(fā)生頻次顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組與對(duì)照組比較，GG型基因與AG、AA型基因的優(yōu)勢(shì)比為OR(GG/AG)=3.75, 95%CI=1.24～6.76, OR(GG/AA)=12.00, 95%CI=3.77～19.25, G基因與A基因的優(yōu)勢(shì)比為OR(G/A)=2.77, 95%CI=1.24～5.68。觀察組兒童MS4A2基因Glu237Gly、TNF-α基因G-308A各基因型及等位基因頻次比較，無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 2組兒童ADRB2、MS4A2、TNF-α基因型及等位基因頻次比較[n(%)]

3 討 論

哮喘是一種多基因遺傳性疾病，具有明顯的家族聚集傾向，其發(fā)生受免疫、遺傳及環(huán)境因素共同影響。SNP是人類最常見的一種可遺傳變異，是在基因組水平上因單個(gè)核苷酸變異所致的DNA序列多態(tài)性，約占已知多態(tài)性90%之多[5]。以分布廣、數(shù)量多、易于基因分型、適于規(guī)范化篩查等為特點(diǎn)，SNP可用于篩查高危人群，鑒定疾病相關(guān)基因，進(jìn)行生物學(xué)基礎(chǔ)研究及藥物設(shè)計(jì)與測(cè)試[6]。隨著基因研究技術(shù)進(jìn)步，哮喘易感基因及SNP方面的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有200多個(gè)基因與哮喘的發(fā)生有關(guān)，其中43個(gè)已得到了多個(gè)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[7]。Ober等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在≥6個(gè)獨(dú)立樣本中能夠重復(fù)的25個(gè)基因與變應(yīng)性疾病/哮喘的表型有關(guān)，這些才是變應(yīng)性疾病哮喘的易感基因。因此，明確哮喘易感基因及其相關(guān)SNP位點(diǎn)在哮喘的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究選取ACE I/D、ADRB2 Arg16Gly、MS4A2 Glu237Gly、TNF-α G-308A的這4個(gè)哮喘易感基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)東營(yíng)地區(qū)兒童哮喘的發(fā)生與ACE I/D、ADRB2 Arg16Gly位點(diǎn)的多態(tài)性相關(guān)。

早在九十年代初，ACE基因的結(jié)構(gòu)就得以闡明，ACE基因位于染色體 17q23，全長(zhǎng)21 kb，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成，該基因第16內(nèi)含子中存在一段287 bp的插入/缺失(I/D)多態(tài)性[9]，根據(jù)個(gè)體等位基因是否存在這一插入片段，ACE基因存在著DD、ID和II三種基因型。這一多態(tài)性與血漿及細(xì)胞內(nèi)ACE水平密切相關(guān)，并參與體內(nèi)ACE調(diào)控[10]，Rigat等[11]研究顯示，DD型表達(dá)者其ACE活性最強(qiáng)，DI次之，II活性最低，DD型約為II型的2倍，并推測(cè)D 等位基因?qū)CE基因的表達(dá)起激活作用，而I等位基因則對(duì)其起抑制作用。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，能將血管緊張素I轉(zhuǎn)換成具有高度血管收縮活性的血管緊張素Ⅱ[12]，ACE還可以作用于P物質(zhì)、緩激肽等炎性介質(zhì)，推測(cè)ACE可以通過誘發(fā)AⅡ的高表達(dá)和調(diào)控氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)，參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程。

對(duì)于ADRB2基因相關(guān)研究大多集中在編碼區(qū)的16與27位的Arg16Gly和Glu27Gln SNP，ADRB2 編碼區(qū)的46突變位點(diǎn)發(fā)生A→G變異，可使編碼的第16位氨基酸分別發(fā)生Arg→Gly的改變，導(dǎo)致氨基酸序列的改變[13]。但目前國(guó)內(nèi)外的諸多報(bào)道中，由于地域、種族、遺傳異質(zhì)性、研究方法等因素的不同，對(duì)于Arg16Gly與哮喘發(fā)生的相關(guān)性研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)論。馮端興等[14]研究發(fā)現(xiàn)Arg16Gly與哮喘的發(fā)生有關(guān)，但Fu等[15]研究中國(guó)南部漢族哮喘人群發(fā)現(xiàn)Argl6Gly多態(tài)性與哮喘無關(guān)。一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，Arg16Gly多態(tài)性與中國(guó)成人哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性無關(guān)[16]，但一項(xiàng)關(guān)于臺(tái)灣兒童哮喘的研究發(fā)現(xiàn)Glyl6與夜間哮喘有關(guān)[17]。有研究顯示，16位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響著長(zhǎng)期使用β2激動(dòng)劑的反應(yīng)性[18]。故對(duì)該位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測(cè)，對(duì)本地區(qū)兒童臨床合理用藥，如沙美羅特的使用具有指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果顯示，觀察組兒童ACE I/D位點(diǎn)，DD型基因、D等位基因發(fā)生頻次顯著升高，同樣在ADRB2 Arg16Gly位點(diǎn)SNP中，觀察組GG型基因、G等位基因的發(fā)生頻次顯著高于對(duì)照組。推測(cè)ACE基因DD型或ADRB2基因Arg16Gly位點(diǎn)GG型的表達(dá)者更具有哮喘的易感性。并發(fā)現(xiàn)觀察組與對(duì)照組比較，ACE基因中OR(DD/ID)=3.50，OR(DD/II)=6.67，ADRB2基因中OR(GG/AG)=3.75，OR(GG/AA)=12.00。表示在正常人群中ACE基因呈DD基因型發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)率約是ID型與II型的4倍和7倍，ADRB2基因呈GG基因型發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)率約是AG型與AA型的4倍和12倍，故可以推測(cè)ACE基因DD基因型、ADRB2基因呈GG基因型可能成為哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。研究中其他兩種哮喘相關(guān)基因的多態(tài)性與哮喘的發(fā)生未見顯著相關(guān)性，且目前的國(guó)內(nèi)外的研究也尚存有不一致甚至相反的結(jié)論，分析可能原因與地區(qū)、種族、遺傳背景等因素有關(guān)，或與本研究的病例數(shù)、研究方法、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的局限性有關(guān)。

綜上所述，哮喘的發(fā)生是由多個(gè)基因多個(gè)因素共同參與的，目前尚處于探索階段，東營(yíng)地區(qū)兒童哮喘的發(fā)病與ACE基因DD基因型和ADRB2 Arg16Gly基因GG基因型的表達(dá)有關(guān)，早期對(duì)兒童哮喘易感基因進(jìn)行檢測(cè)，篩選易患人群，及早干預(yù)，指導(dǎo)用藥，可有效防治哮喘。

[1] 李飛, 李為娟, 高金明.支氣管哮喘遺傳學(xué)的研究進(jìn)展與展望[J].中華哮喘雜志: 電子版, 2010, 4(4): 226.

[2] Bijanzadeh M, Mahesh P A, Ramachandra N B.An understanding of the genetic basis of asthma[J].The Indian journal of medical research, 2011, 134(2): 149.

[3] Seeb J E, Carvalho G, Hauser L, et al.Single nucleotide polymorphism (SNP) discovery and applications of SNP genotyping in nonmodel organisms[J].Molecular Ecology Resources, 2011, 11(s1): 1.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組, 中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志, 2008, 46(10): 745.

[5] 程云杰, 王雅棣.單核苷酸多態(tài)性與腫瘤易感性[J].河北醫(yī)藥, 2010, 32(9): 1134.

[6] 孫敏英, 李粉霞, 楊學(xué)習(xí), 等.IL-10、MD-1基因單核苷酸多態(tài)性與哮喘易感性的相關(guān)性研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2010, 26(12): 1096.

[7] 李倩, 欒斌, 宋麗, 等.135 例兒童過敏性哮喘遺傳易患性研究[J].國(guó)際兒科學(xué)雜志, 2014, 41(002): 189.

[8] Ober C, Hoffjan S.Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene discovery[J].Genes and immunity, 2006, 7(2): 95.

[9] Glenn K L, Du Z Q, Eisenmann J C, et al.An alternative method for genotyping of the ACE I/D polymorphism[J].Molecular biology reports, 2009, 36(6): 1305.

[10] 龔原忠, 吳斌.慢性阻塞性肺疾病并發(fā)肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)基因多態(tài)性的研究[J].國(guó)際呼吸雜志 ISTIC, 2010, 30(21).

[11] Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, et al.An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels[J].Journal of Clinical Investigation, 1990, 86(4): 1343.

[12] 顧秋芳, 邱全芳, 周文浩.高原地區(qū)低氧與胎兒新生兒呼吸循環(huán)相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國(guó)循證兒科雜志, 2012, 4: 027.

[13] Bonini M, Permaul P, Kulkarni T, et al.Loss of salmeterol bronchoprotection against exercise in relation to ADRB2 Arg16Gly polymorphism and exhaled nitric oxide[J].American journal of respiratory and critical care medicine, 2013, 188(12): 1407.

[14] 馮端興, 張湘燕, 葉賢偉, 等.支氣管哮喘 β2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與發(fā)病機(jī)制的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2005, 28: 271.

[15] FU W E I P, ZHAO Z H I H, Zhong L, et al.Relationship between polymorphisms in the 5′ leader cistron, positions 16 and 27 of the adrenergic β2 receptor gene and asthma in a Han population from southwest China[J].Respirology, 2011, 16(8): 1221.

[16] Li X, Zhang Y, Zhang J, et al.Asthma susceptible genes in Chinese population: a meta-analysis[J].Respir Res, 2010, 11(1): 129.

[17] Lee M Y, Cheng S N, Chen S J, et al.Polymorphisms of the β2-adrenergic receptor correlated to nocturnal asthma and the response of terbutaline nebulizer[J].Pediatr Neonatol, 2011, 52: 18.

[18] 邱玉英.β2腎上腺素能受體基因單倍型/多態(tài)性與哮喘及其臨床表型的相關(guān)研究[D].南京醫(yī)科大學(xué), 2007.