朱際平, 袁冬平

(1.江蘇省中醫(yī)院 呼吸科, 江蘇 南京, 210029; 2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院, 江蘇 南京, 210029)

苦參為豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait)的干燥根。具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效，用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、濕疹、皮膚瘙癢等證?？鄥⒅泻卸喾N生物堿：苦參堿、氧化苦參堿、槐花醇1-臭豆堿、1-甲基金雀花堿、1-穿葉贗靛堿及槐果堿，以及多種黃酮類成分。而目前研究較多的為屬于四環(huán)喹嗪啶類化合物的苦參堿(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)其具有抗病毒、抗感染、抗腫瘤作用及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱降溫和強心、降壓、抗心率失常等多種藥理作用。近期關(guān)注的熱點主要是其抗腫瘤活性，針對肝癌和白血病細胞進行了較為廣泛而深入的研究。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿具有體外抗腫瘤作用，可抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化。本研究探討氧化苦參堿抗腫瘤肺轉(zhuǎn)移的作用和機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與細胞

清潔級C57BL/6J小鼠，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號: SCXK(滬)2010-0006; B16-BL6黑色素瘤細胞株，中科院上海細胞所提供。

1.2 試劑

氧化苦參堿(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司); RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco, USA); 小牛血清(維森特，20130118), Trypsin (Amresco); 二甲基亞砜(DMSO)(分析純，蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma)。

1.3 儀器和設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(Forma scientific); Biotek Synerge 2酶標(biāo)儀(Biotek); Zeiss AVIVO型倒置顯微鏡(Zeiss)。

1.4 細胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)B16-BL6腫瘤細胞，實驗前4～5 d, 按1∶10，細胞傳代于細胞培養(yǎng)瓶中，以免細胞生長過度而出現(xiàn)不完全匯合。每個培養(yǎng)瓶大約含6～8×106細胞，取對數(shù)生長期的細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗凈。加入1 mL 0.25%胰酶0.02% EDTA消化液，放入細胞培養(yǎng)箱當(dāng)中, 1～3 min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細胞脫落。加10 mL DMEM, 用移液管吹打細胞，獲得單細胞懸液，轉(zhuǎn)入50 mL聚丙烯離心管。離心細胞(1 200 r/min×10 min), 然后用PBS洗2遍。用苔盼藍計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為2.5×106cells/mL。

1.5 MTT法檢測細胞增殖抑制

將氧化苦參堿溶解后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基依次對半稀釋成5個梯度的母液，取對數(shù)生長期B16-BL6細胞，以每孔190 μL (約1×104cells/孔)接種于96孔板，細胞培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度(0、1、10、20、50、100 μmol/L)的氧化苦參堿10 μL, 每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。另外設(shè)空白對照孔3個，只加完全培養(yǎng)基200 μL，不加細胞，孵育48 h后每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL), 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后仔細吸去上清液，加入DMSO 150 μL/孔，平板振蕩器振蕩5 min, 空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀以570 nm測定去除本底光吸收值后的吸光度值(OD值)，計算細胞增殖抑制率。抑制率=(1-樣品OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復(fù)3次, Bliss法計算IC50。

1.6 實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移模型

取C57BL6小鼠置于小鼠注射固定器，由尾靜脈注射0.2 mL B16-BL6細胞懸液，含5×105腫瘤細胞。隨后小鼠隨機分為3組，每組動物數(shù)為12只，分別為模型組、氧化苦參堿低劑量組(20 mg/kg)和氧化苦參堿高劑量組(40 mg/kg), 小鼠每天灌胃給藥。23 d時處死小鼠，取肺、心、肝、脾、腎、膀胱。避免鑷子觸及臟器表面，防止損傷組織，用冷生理鹽水洗凈組織。其中一葉肺組織用10%甲醛固定，肉眼觀察并計算肺組織表面黑色素瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，同時解剖顯微鏡下計數(shù)肺組織切片中的腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)等。另一葉肺定量剪取肺組織進行組織勻漿，并保存于-20 ℃, 用ELISA試劑盒檢測其MMP-2和MMP-9的含量。

2 結(jié) 果

2.1 氧化苦參堿對B16-BL6細胞的抑制作用

氧化苦參堿對B16-BL6黑色素瘤細胞有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其IC50值為38.6 μmol/L。見圖1。

圖1 氧化苦參堿體外對B16-BL6細胞的抑制作用

2.2 氧化苦參堿對B16-BL6肺轉(zhuǎn)移的影響

圖2 氧化苦參堿對肺轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤結(jié)節(jié)的影響

氧化苦參堿給藥組中小鼠肺中的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)與模型組小鼠的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較明顯少于模型組(圖2)(P<0.05或P<0.01)，說明氧化苦參堿對黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移有干擾作用，可以減少黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。

2.3 氧化苦參堿對肺轉(zhuǎn)移小鼠肺組織MMP-2,MMP-9表達的影響

實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移模型中，通過將黑色素瘤細胞直接靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，由血液運送轉(zhuǎn)移至各個臟器形成轉(zhuǎn)移并生長。實驗結(jié)果顯示小鼠的肺部轉(zhuǎn)移明顯，而在其他臟器中則未發(fā)現(xiàn)明顯的黑色素腫瘤轉(zhuǎn)移。同時在對肺組織中的MMPs的檢測中發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿給藥組小鼠肺組織中的MMP-2、MMP-9的表達量要明顯少于模型組。見表1。

表1 氧化苦參堿對肺轉(zhuǎn)移小鼠肺組織MMPs的影響(n=8)

3 討 論

近年來多項研究表明氧化苦參堿對腫瘤細胞具有抑制生長，增殖和促凋亡的作用，而其作用機制多樣。Ling[2]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿通過調(diào)節(jié)Bcl-2和LAP，導(dǎo)致胰腺癌PANC-1細胞線粒體細胞色素c的釋放和激活caspase-3導(dǎo)致細胞凋亡。Chen[3]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿減少血管再生相關(guān)因子表達，包括核因子NF-κB和血管內(nèi)皮再生因子VEGF，產(chǎn)生抗腫瘤增生和抗血管生成的作用。Li等[4]研究表明，氧化苦參堿可能通過抑制肌酐磷酸脫氫酶2(IMPDH2)導(dǎo)致宮頸癌細胞凋亡。Zhang等[5]研究表明，氧化苦參堿通過抑制骨肉瘤細胞Bcl-2，增加Bax表達，導(dǎo)致線粒體功能喪失，促進細胞凋亡，還可以激活caspase-9 and -3, 抑制(PI3K) Akt信號通路，抑制骨肉瘤細胞增殖。除此以外，氧化苦參堿可能對腫瘤干細胞也有抑制作用，Zhang等[6]對乳腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿通過抑制側(cè)群細胞和Wnt/β-catenin信號通路抑制MCF-7乳腺癌細胞的生長。體外細胞增殖實驗顯示氧化苦參堿對腫瘤細胞有明顯抑制作用，其半數(shù)抑制率在40 μg/mL左右。實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示氧化苦參堿可明顯抑制黑色素瘤轉(zhuǎn)移，同時高低兩個劑量組都抑制肺組織MMP-2/MMP-9的表達。說明氧化苦參堿抑制腫瘤轉(zhuǎn)移與抑制MMPs的表達正相關(guān)。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程。簡單而言可以看作腫瘤細胞分解細胞外基質(zhì)，與正常細胞黏附的結(jié)果。在此過程中細胞突破組織的基底膜結(jié)構(gòu)是重要的一步?，F(xiàn)代研究[7]普遍認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的中介物，它可以降解組織連結(jié)構(gòu)成的屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是血管內(nèi)皮基底膜降解主要的蛋白水解酶類。MMPs 是具有高度同源性的能降解基底膜的水解酶類,幾乎能降解 ECM 中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。迄今為止，在人類至少已發(fā)現(xiàn)有19種之多,構(gòu)成MMPs 超家族。MMPs 各成員均有特異的底物，據(jù)此可作分類:膠原酶(MMP-1, MMP-8, MMP-13)、明膠酶又稱Ⅳ型膠原酶(MMP-2、MMP-9)、基質(zhì)溶酶(MMP-3, MMP-10, MMP-11)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-14,MMP -15, MMP-16)等[8]。MMP-2, MMP-9是腫瘤細胞突破基底膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移的重要的蛋白酶。研究[9]證明MMP-2, MMP-9的表達強度對于腫瘤生長活性和轉(zhuǎn)移能力有重要的調(diào)節(jié)作用。多項研究表明MMP-2, MMP-9受多種信號通路的調(diào)節(jié)，對其表達強度進行控制，以介導(dǎo)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。Zhao等[10]的研究表明肺癌細胞通過整合素連接激酶(ILK), 通過NF-KB介導(dǎo)MMP-9的表達上調(diào)研究在肺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯的增強，反之在MMP-9中和抗體的作用下細胞的遷移能力明顯受到抑制。而針對MMP-2的重組型組織型MMP-2抑制劑, r-hTIMP-2, 可以減少黑色素瘤細胞靜脈注射轉(zhuǎn)移動物模型的肺轉(zhuǎn)移[11]。Wang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞中的胞內(nèi)氯離子通道1(CLIC1)通過其介導(dǎo)的ROS/ERK通路對MMP-2,MMP-9的表達進行調(diào)節(jié)，對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移浸潤能力進行調(diào)節(jié)。LU[13]研究指出人類腫瘤細胞s期激酶相關(guān)蛋白2均存在過表達，而s期激酶相關(guān)蛋白2通過上調(diào)MMP-2, MMP-9, 下調(diào)組織型基質(zhì)金屬蛋白抑制酶促進腎癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。可見多種機制雖然調(diào)節(jié)機制和通路不同，但最終通過MMP-2, MMP-9的表達活性的變化，使腫瘤細胞表現(xiàn)出或強或弱的轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，高低兩個劑量的治療組, MMP-2, MMP-9的表達活性與模型組比較顯著降低，治療組間的表達活性也存在差異，與轉(zhuǎn)移程度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此推測治療組轉(zhuǎn)移程度低與MMP-2, MMP-9的表達被抑制有關(guān)。

本研究中采用的是靜脈注射腫瘤轉(zhuǎn)移模型，這種模型有很高的腫瘤轉(zhuǎn)移率。近年來采用這個模型進行研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，這一模型采用B16-BL6黑色素瘤細胞在靜脈注射后癌細胞主要堆積肺泡的毛細血管中，后隨著細胞的浸潤進入肺組織。本研究小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肺部，其他臟器沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤的特點是符合文獻報道的特點的。但這一模型也存在不足，對腫瘤組織和微環(huán)境之間的關(guān)系的還原比原位移植腫瘤模型差[16]。今后可進一步研究，并對氧化苦參堿抗轉(zhuǎn)移的具體的干預(yù)信號通路進行探討。

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