王海燕，黃愛(ài)民，晉 雯，高凌云，高美欽(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究室,福建 福州 350004)

·論著·

RNA干擾畸胎瘤細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子基因?qū)θ烁渭?xì)胞癌HepG2增殖和侵襲的影響

王海燕，黃愛(ài)民*，晉 雯，高凌云，高美欽
(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究室,福建 福州 350004)

目的探討RNA干擾畸胎瘤細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子(PC cell-derived growth factor，PCDGF)基因?qū)Ω渭?xì)胞癌細(xì)胞HepG2增殖和侵襲的影響。方法采用脂質(zhì)體法將PCDGF-shRNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫蛋白印跡(Western Blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PCDGF mRNA和蛋白的表達(dá)，噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞體外增殖能力，體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染后，與未轉(zhuǎn)染組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和脂質(zhì)體)、脂質(zhì)體組(轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體)和陰性質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒)相比，轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染PCDGF-shRNA質(zhì)粒) HepG2細(xì)胞的PCDGF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，細(xì)胞的增殖能力受到抑制(P<0.01)，細(xì)胞的侵襲能力也明顯降低(P<0.01)。結(jié)論RNA干擾PCDGF基因可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的體外增殖及侵襲能力，PCDGF基因可能成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。

肝腫瘤；RNA干擾；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤(rùn)

肝細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病死率在全球惡性腫瘤中居第3位。我國(guó)肝癌的發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，其侵襲力強(qiáng)，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的研究在腫瘤預(yù)后和指導(dǎo)臨床治療方面具有重要意義?；チ黾?xì)胞源性生長(zhǎng)因子(PCcell-derivedgrowthfactor，PCDGF)，也稱為顆粒素-上皮素前體 (granulin-epithelinprecursor，GEP)，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種自分泌的生長(zhǎng)因子。研究[1]發(fā)現(xiàn)PCDGF具有高致瘤活性，能促進(jìn)某些上皮和間葉源性腫瘤的增殖、侵襲。關(guān)于PCDGF與肝細(xì)胞癌的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將PCDGF-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響，以期為肝癌的早期診斷及治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料及試劑：從基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank)中檢索出人類PCDGF基因序列(NM002087.2)；含PCDGF一段特異序列的PCDGF-shRNA質(zhì)粒及陰性質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建并提供。肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由本中心實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，脂質(zhì)體Lipofectamine購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，TripureIsolationReagent試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，PCR試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司，兔抗人PCDGF多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ProteintechGroup公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自上海碧云天公司，噻唑藍(lán)(thiazolylbluetetrazoliumbromide,MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，基質(zhì)膠(Matrigel)、纖維黏連蛋白(Fibronectin)購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：肝癌細(xì)胞株HepG2用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合作為待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前4h更換上述培養(yǎng)液1次。載體轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染操作按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行，分別轉(zhuǎn)染能表達(dá)PCDGF-shRNA的質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后4～6h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)染PCDGF-shRNA質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞分別命名為轉(zhuǎn)染組和陰性質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的HepG2細(xì)胞命名脂質(zhì)體組，未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞命名為未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染率=熒光細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)PCDGFmRNA的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48h后分別提取轉(zhuǎn)染組、陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GeneBank的基因序列并應(yīng)用軟件PrimerDesigner5.0設(shè)計(jì)引物。PCDGF正義鏈5′-ACTCCTGCATCTTTACCGTCTC-3′，反義鏈5′-CTCACAGCAGGTAGAACCATCA-3′，預(yù)計(jì)目的基因產(chǎn)物為458bp。內(nèi)參為β-actin，正義鏈5′-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3′，反義鏈5′-CCACGTCACACTTCATGATGG- 3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度240bp。PCR反應(yīng)總體積為25μL，反應(yīng)體系為2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，去離子水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照并分析。

1.2.3 免疫蛋白印跡(WesternBlot)檢測(cè)PCDGF蛋白的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48h后提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%分離膠和4%濃縮膠)。將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，以5%脫脂奶封閉2h，加入兔抗人PCDGF多克隆抗體(1∶200)，4℃過(guò)夜，TBS-T(TrisBufferedSalinewithTween20)洗膜10min×3次，后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶1 000)二抗，37℃孵育2h，TBS-T洗膜10min×5次，化學(xué)發(fā)光試劑顯色1～2min，用X光片顯影，以β-actin作為內(nèi)參照。圖像用凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：轉(zhuǎn)染24h后，將轉(zhuǎn)染組、陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，每孔按4×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于接種后24h、48h、72h、96h、120h，每孔加入20μL的MTT(5g/L)混勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)，振蕩10min，以波長(zhǎng)570nm酶標(biāo)儀檢測(cè)，吸光度(A)值表示細(xì)胞增殖情況，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 體外侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell侵襲小室聚碳酸酯膜外側(cè)滴加10μLFibronectin(0.5g/L)風(fēng)干，膜內(nèi)側(cè)加入20μLMatrigel(原液12g/L，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液按1∶6稀釋)，風(fēng)干。轉(zhuǎn)染后24h，將轉(zhuǎn)染組、陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別重懸于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，于小室上室內(nèi)分別加入200μL(含4×104個(gè)細(xì)胞)上述細(xì)胞懸液，下室加600μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。取出小室棄除上室液體，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細(xì)胞，室溫下甲醇固定10min，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，400倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，取其平均值，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定：將PCDGF-shRNA質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24～72h倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，48h熒光表達(dá)最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到55%(圖1)。故后續(xù)試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行。

2.2 各組PCDGFmRNA、PCDGF蛋白的表達(dá)和細(xì)胞侵襲能力：轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR及WesternBlot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染組PCDGFmRNA和蛋白表達(dá)均低于未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和陰性質(zhì)粒組(P<0.01)；而未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組、陰性質(zhì)粒組PCDGFmRNA和蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染PCDGF-shRNA后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)也均明顯低于未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和陰性質(zhì)粒組(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖2～4。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：為了探討PCDGF-shRNA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法測(cè)定未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組、陰性質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的A570nm值，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組、陰性質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染組均有增殖，4組在組間、不同時(shí)點(diǎn)以及組間和不同時(shí)點(diǎn)的交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染組增殖能力明顯低于未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和陰性質(zhì)粒組。見(jiàn)表2。

GroupsPCDGFmRNAPCDGFproteinCellnumberofinvadingthroughmembranceNon?transfection0．978±0．0130．775±0．02454．500±0．707Liposome0．961±0．0040．753±0．06350．500±13．435Negativevector0．948±0．0150．717±0．05747．500±9．192Transfection0．385±0．057?#△0．366±0．018?#△17．333±4．726?#△ F273．77854．86512．039 P0．0000．0000．003

*P<0.01vsnon-transfection group #P<0.01vsliposome group △P<0.01vsnegative vector group

GroupsA570nmvalue24h48h72h96h120hNon?transfectiongroup0．194±0．0410．296±0．0240．428±0．0210．573±0．0300．764±0．107Liposomegroup0．187±0．0260．275±0．0240．418±0．0420．544±0．0150．732±0．072Negativevectorgroup0．146±0．0470．266±0．0420．399±0．1270．540±0．0480．652±0．085Transfectiongroup0．113±0．0220．187±0．0130．241±0．0160．250±0．0250．270±0．026GroupsF=76．185 P=0．000TimeF=310．892 P=0．000Time·GroupsF=16．435 P=0．000

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)內(nèi)外因素相互作用的復(fù)雜的多步驟過(guò)程，它與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的作用因素失衡致使細(xì)胞生長(zhǎng)失控密切相關(guān)。一些生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、皮質(zhì)激素等被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中是表達(dá)異常的，生長(zhǎng)因子及其受體的過(guò)度表達(dá)是參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與惡性表型轉(zhuǎn)化的因素之一[2]。PCDGF是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)因子，它最早是從鼠畸胎瘤PC細(xì)胞系條件培養(yǎng)基中純化的一種相對(duì)分子質(zhì)量88 000的糖蛋白，是生長(zhǎng)因子家族中相對(duì)分子質(zhì)量最大的成員。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)PCDGF具有多種生物學(xué)功能，如參與胚胎發(fā)育、傷口修復(fù)、炎癥調(diào)節(jié)、神經(jīng)退行性病變。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中PCDGF同樣發(fā)揮重要作用。它與某些上皮和間葉源性腫瘤如乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、皮膚鱗癌[7]、惡性膠質(zhì)瘤[8]等的發(fā)生侵襲以及腫瘤細(xì)胞的增殖與存活密切相關(guān)。在肝細(xì)胞癌中Cheung等[9]研究也顯示肝癌組織中PCDGF的表達(dá)較非瘤組織和正常肝組織顯著增高，它的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)與肝癌早期肝內(nèi)復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Park等[10]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示抑制PCDGF表達(dá)可抑制裸鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些現(xiàn)象均提示PCDGF促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

RNA干擾( RNA interference，RNAi) 是近年來(lái)基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)之一[11]。它是由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA) 介導(dǎo)的特異性降解相應(yīng)序列的mRNA，導(dǎo)致靶基因的沉默，是一種抑制特定基因產(chǎn)物表達(dá)的有效方法，在腫瘤及干細(xì)胞等前沿研究領(lǐng)域顯示出巨大的潛能。

本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCDGF在肝癌細(xì)胞株HepG2高表達(dá)，故選用HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。本研究利用脂質(zhì)體2000將PCDGF-shRNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組、陰性質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組相比，轉(zhuǎn)染組、陰性質(zhì)粒組均有熒光的表達(dá)，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染率達(dá)55%。利用RT-PCR以及Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PCDGF mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組的PCDGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均較陰性質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組和未轉(zhuǎn)染組明顯降低(P<0.01)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力受到抑制(P<0.01)。這與梁佳等[12]采用 RNA干擾技術(shù)特異性沉默PCDGF基因在鼻咽癌細(xì)胞株HNE-1中的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的異常增殖相一致。其原因是與PCDGF通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途徑、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3′-kinase，PI3K) 途徑和局部黏附激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK) 途徑來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)。因此，沉默PCDGF基因可能通過(guò)抑制上述途徑調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖。Transwell是檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究采用Transwell小室檢測(cè)沉默PCDGF基因?qū)epG2細(xì)胞體外侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組、陰性質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞體外侵襲能力明顯降低(P<0.01)。這與鄭慶豐等[13]針對(duì)PCDGF的短發(fā)卡RNA可降低Eca-109食管癌細(xì)胞株的侵襲能力相一致。表明干擾PCDGF可以影響肝癌的惡性生物學(xué)行為，降低肝細(xì)胞癌的侵襲潛能。

總之，RNA干擾技術(shù)通過(guò)抑制PCDGF基因表達(dá)，對(duì)肝癌增殖侵襲起抑制作用。相信隨著對(duì)肝癌作用及調(diào)控機(jī)制的深入研究和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCDGF可望成為肝癌基因治療的新靶點(diǎn)和輔助診斷的指標(biāo)。(本文圖見(jiàn)封二)

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(本文編輯：許卓文)

INTERFERENCEOFPCCELL-DERIVEDGROWTHFACTORRNAONPROLIFERATIONANDINVASIONOFHUMANHEPATOCELLULARCARCINOMACELLLINEHEPG2

WANGHaiyan,HUANGAimin*,JINWen,GAOLingyun，GAOMeiqin
(DepartmentofPathology,CollegeofBasicMedicalSciences,TumorResearchInstitute,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofPCcell-derivedgrowthfactor(PCDGF)RNAonhepatocellularcarcinomacellsHepG2invitro.MethodsThePCDGF-shRNAexpressionvectorwastransfectedintohepatocellularcarcinomacellsHepG2bylipofectiontechnology.TheexpressionofPCDGFmRNAandproteinweredetectedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)andWesternBlot,respectively.TheabilityoftumorcellproliferationwasdeterminedbyMTTassay.TheeffectofPCDGFexpressiononinvasionwasalsoidentifiedbytranswellchambersystem.ResultsTheexpressionofPCDGFmRNAandproteinwerebothdecreasedinthetransfectiongroupthaninthenon-transfectiongroup,liposomegroupandnegativevectorgroup(P<0.01).TheMTTshowedcellproliferationactivitywasinhibitedinthetransfectiongroup(P<0.01).Transwellexperimentsshowedthatcellinvasionabilitywaslowerinthetransfectiongroupcomparedwiththatinthenon-transfection,liposomeandnegativevectorgroups(P<0.01).ConclusionPCDGFRNAinterferencecaninhibittheproliferationandinvasionabilitiesofhepatocellularcarcinomacellsinvitro.PCDGFgenemaybethenewtargetofgenetherapy.

liverneoplasms;RNAinterference;cellproliferation;neoplasminvasivess

2014-04-02；

2014-04-22

福建省教育廳課題(JA10133)；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題(2010-1-19)

王海燕(1971-)，女，福建龍海人，福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院講師,醫(yī)學(xué)碩士，從事腫瘤病理研究。

*通訊作者。E-mail:aimin@mail.fjmu.edu.cn

R735.7

A

1007-3205(2014)11-1291-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.015