楊 冬，王 切，米立國*，張 玉(.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05005；.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北 石家莊05007；.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病二科，河北 石家莊 0500)

·論著·

TNNI3K基因表達與大鼠心肌肥厚形態(tài)學變化相關性研究

楊 冬1，王 切2，米立國2*，張 玉3
(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北 石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病二科，河北 石家莊 050011)

目的觀察心肌肥厚發(fā)生和發(fā)展過程中心臟結構的變化，及其與TNNI3K表達的相關性。方法采用腹主動脈縮窄術制備壓力超負荷大鼠模型；通過HE染色、投射電鏡觀察心肌肥厚形態(tài)學變化；利用免疫組織化學染色法檢測模型中TNNI3K基因的蛋白表達情況。結果各對照組心肌纖維排列整齊；2周模型組的心肌細胞彌漫性肥大，線粒體增多；4周模型組的心肌細胞更加肥大，心肌纖維走行紊亂，可見間質纖維化；6周模型組的心肌細胞進一步肥大，肌纖維斷裂，線粒體密集增多并可觀察到死亡細胞。TNNI3K mRNA和蛋白的相對表達量逐步增強。結論隨著超負荷心肌肥厚的發(fā)展，TNNI3表達逐漸增強，表明其參與了超負荷心肌肥厚的發(fā)生。

心肌病，肥厚性；基因表達；大鼠

心肌肥厚是心肌細胞對多種損害心臟泵功能的病理性刺激的一種代償反應，以代償性增加心臟的泵血功能。在持續(xù)性刺激(力學信號、神經激素信號和細胞因子信號等)作用下，心肌細胞肥大，引發(fā)心室重塑，最終致使心功能受損，以至于心力衰竭[1]。因此，抑制病理性心肌肥厚的進展是控制心力衰竭發(fā)生的一條有效途徑。在心肌肥厚發(fā)生的分子機制中，首先即刻早期基因被激活，隨之胎兒型基因被重新激活,肌球蛋白和肌動蛋白的基因等表達增強[2-3]。人心肌特異表達心激酶(cTnI-interactingkinase，TNNI3K)是在心臟特異性表達的心激酶基因，其cDNA全長約3 420bp，編碼835個氨基酸，蛋白相對分子質量約為93 000[4]。分別以該基因的C末端和N末端序列為誘餌，經醇母雙雜發(fā)現，心肌肌鈣蛋白I(cardiactroponinI，cTnI)和心肌肌動蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調節(jié)蛋白基因為該基因的相關分子。推測TNNI3K可能通過一條未知的信號傳導通路參與了對肌小節(jié)收縮蛋白的調控，進而調控心肌收縮能力?，F將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：TNNI3K單克隆抗體(阜外心血管病醫(yī)院孟憲敏教授提供)；谷氨酰胺、丙酮酸鈉、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)購于上海今邁生物科技有限公司；SP檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司產品；二抗試劑盒(SP工作液試劑盒)購自北京中山生物技術公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)試劑盒購于Promega公司。

1.2 實驗動物和取材：選用體質量190～200g健康雄性SD大鼠，由河北省實驗動物中心提供。隨機分為模型組和對照組，依據Anversa等[5]的方法實施腹主動脈縮窄術，制備動物模型，對照組只分離左腎動脈上方腹主動脈，并不結扎，其他步驟與模型組相同。術后2、4和6周時，每組各取8只，開胸取心。分離左心室，一部分放入液氮中用于總RNA的提取；一部分放入3%多聚甲醛和1%戊二醛混合固定液中固定，用于投射電鏡；另一部分放入4%多聚甲醛固定液內固定，用于HE染色和免疫組織化學染色。

1.3 組織切片HE染色和觀察：組織塊常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片厚度5μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察心肌纖維形態(tài)變化，日本產Nikon光學顯微鏡下拍照。采用(Imageproplus6.0)圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.4 透射電鏡樣品制備并觀察心肌細胞的超微結構變化：常規(guī)固定、包埋，超薄切片(50nm)，載于200目銅網上；經醋酸鈾和檸檬酸鉛電子染色，用Hitachi-7500型透射電鏡觀察、拍攝照片，加速電壓為80kV。

1.5 心肌組織TNNI3K免疫組織化學測定(SP法)：石蠟切片常規(guī)脫蠟及免疫組織化學染色。采用(Imageproplus6.0)圖像分析系統(tǒng)，將載玻片置于光學顯微鏡(×400)下，隨機挑選陽性細胞，更換視野，經微機處理后得出各組平均光密度及標準差。光密度越大表示抗原含量越高。

1.6 用Trizol法提取總RNA：以GAPDH為內參照，進行RT-PCR。PCR引物(由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成)GAPDH，上游，5′GCTGAGTATGTCGTGGAGT3′，下游，5′TCTTCTGAGTGGCAGTGAT3′；TNNI3K，上游，5′CATTGTGAAACTCCTGGTA3′，下游，5′AGGTGTTGGCTCGGTAT3′。取PCR產物各5μL進行電泳、拍攝照片，經成像分析系統(tǒng)分析擴增產物的積分光密度值(integratedopticaldensity，IOD)，計算目的RNA的相對表達量。

2 結 果

2.1 左心室壁的組織學變化：分別隨機選取結構清晰、完整心肌細胞35個，取心肌細胞核40個，進行對比觀察。對照組心肌纖維排列整齊，模型組較對照組細胞直徑及細胞核直徑明顯增大(P<0.01)；模型組各時點間細胞直徑差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，細胞核直徑逐漸增大(P<0.05)；對照組各時點間細胞直徑及細胞核直徑比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，2。

2周模型組的心肌細胞彌漫性肥大，核深染。4周模型組的心肌細胞較2周更加肥大，心肌纖維走行紊亂，肌纖維間隙增寬，并可見間質纖維化。6周模型組，心肌細胞進一步肥大，肌纖維走行紊亂、斷裂，間質纖維化嚴重(圖 1)。

GroupsDiameterofcardiacmyocytes2weeks4weeks6weeksFPControl9．71±1．049．61±0．719．89±0．721．0050．369Model15．35±0．9315．75±0．8015．86±1．142．6970．072 t23．91633．96026．195 P0．0000．0000．000

GroupsDiameterofcardiacmyocytesnucleus2weeks4weeks6weeksFPControl2．42±0．412．42±0．432．48±0．390．2850．752Model3．47±0．533．53±0．183．68±0．263．3180．039 t9．91015．05916．192 P0．0000．0000．000

圖1 6周模型組左心室心肌細胞(HE ×100)
Figure 1 HE staining for left ventricle of 6 weeks-model(HE ×100)

2.2 大鼠左心室壁的超微結構變化：隨機挑選結構清晰心肌細胞50個，進行電鏡觀察，對照組各時點大鼠心肌原纖維排列整齊，明帶、暗帶、Z線及閏盤清晰，肌節(jié)長約1.63μm。線粒體分布在心肌原纖維之間，多為橢圓形，呈串珠狀排列，線粒體嵴清晰呈板層狀排列，較稀疏。腹主動脈縮窄術后2周時，心肌原纖維整齊，閏盤和肌節(jié)清晰，肌節(jié)增長；線粒體逐漸增多，并出現集結現象，集結處線粒體多呈圓形，線粒體嵴排列密集；間質中微血管擴張，2周細胞的胞核染色質凝聚成塊狀，并邊聚化，提示早期凋亡。術后4周時，肌節(jié)長度與2周近似。但線粒體集結現象增強，集結處線粒體數量增多，排列密集，線粒體嵴的形狀和排列與2周組近似；細胞間質中除可見微血管擴張及早期凋亡的周細胞外，還可見晚期凋亡細胞，細胞核皺縮，其染色質凝聚，邊聚化，出現凋亡小體。術后6周組時，肌節(jié)增長，線粒體集結處出現排列疏松區(qū)，線粒體嵴逐漸密集，線粒體嵴較其他組增厚?？梢杂^察到死亡的心肌細胞，其胞膜崩解，大部細胞器溶解，可見少量外形完整的圓形線粒體，細胞核皺縮，染色質凝聚，并邊聚化。見表3，圖2。

GroupsLengthofmyocomma2weeks4weeks6weeksFPControl1．62±0．051．62±0．041．63±0．035．6430．213Model1．83±0．031．85±0．051．93±0．02316．0110．000 t7．3177．31718．299 P0．0000．0000．000

圖2 左心室超微結構(電子顯微鏡 ×5 000)

A.2周對照組；B.2周模型組；C.4周模型組；D.6周模型組

Figure 2 The ultrastructure of left ventricle(電子顯微鏡 ×5 000)

A.Control of 2 weeks；B.Model of 2 weeks；C.Model of 4 weeks；D.Model of 6 weeks

2.3 TNNI3K mRNA表達: 隨機挑選陽性細胞50個，腹主動脈縮窄術后2周時，TNNI3K mRNA和蛋白相對表達量略低于對照組，術后4、6周時，TNNI3K mRNA和蛋白的相對表達量高于對照組(P<0.01)。實驗組TNNI3KmRNA和蛋白相對表達隨時間延長為逐漸增加的趨勢(P<0.01)，對照組TNNI3KmRNA相對表達隨時間延長為逐漸增加的趨勢(P<0.01)，但TNNI3K蛋白相對表達隨時間延長為逐漸減少的趨勢(P<0.01)。見圖3～5,表4，5。

圖3 TNNI3K mRNA在室間隔的表達

M4W：4周模型組;C4W：4周對照組；M2W：2周模型組;C2W：2周對照組；M24H：24h模型組；C24H：24h對照組

Figure 3 The expression of TNNI3K mRNA in interventricular septum

C4W：Control of 4 weeks；M4W:Model of 4 weeks;C2W：Control of 2 weeks；M2W:Model of 2 weeks;C24H:Control of 24 hours;M24H:Model of 24hours

圖4 TNNI3K mRNA在室間隔的表達

M6W：6周模型組;C6W：6周對照組

Figure 4 The expression of TNNI3K mRNA in interventricular septum

M6W:Model of 6 weeks；C6W：Control of 6 weeks

圖5 左心室TNNI3K 表達(免疫組織化學 ×200)

A.2周對照組；B.2周模型組；C.4周對照組；D.4周模型組； E.6周對照組；F.6周模型組

Figure 5 The expression of TNNI3K in the left ventricle detected by immunohistochemistry staining method

A.Control of 2 weeks;B.Model of 2 weeks;C.Control of 4 weeks;D.Model of 4 weeks;E.Control of 6 weeks;F.Model of 6 weeks

GroupsmRNAexpressionofTNNI3K2weeks4weeks6weeksFPControl0．43±0．060．42±0．040．59±0．06155．1140．000Model0．41±0．030．57±0．070．76±0．08377．4590．000 t2．10813．15612．021 P0．0370．0000．000

GroupsExpressionofTNNI3Kprotein2weeks4weeks6weeksFPControl0．16±0．020．15±0．020．15±0．015．5560．005Model0．15±0．010．17±0．020．20±0．02955．5560．000 t3．1625．00015．811 P0．0020．0000．000

3 討 論

心肌肥厚是由于心肌細胞受到不同的刺激因素(如機械牽拉、神經內分泌等)而導致的適應性反應，其產生機制復雜，由超負荷的血流動力學變化而作用于心室壁，最后導致機械壓力的增加是引起心肌肥厚的最主要原因[6]。本研究利用腹主動脈縮窄術成功制備心臟肥厚模型，在腹主動脈狹窄后2～6周，心肌細胞的直徑、心肌細胞核的直徑及肌節(jié)長度均增加，線粒體集結增多，線粒體脊密集增厚，并且在中、晚期觀察到間質纖維化和死亡細胞，死亡細胞的胞質崩解，大部分細胞器溶解，并有少量圓形線粒體，細胞核皺縮染色質凝聚、邊聚化。本研究結果顯示，模型組發(fā)生心肌肥厚，并且逐漸由代償性肥厚向失代償性肥厚進展，模型組TNNI3K mRNA和蛋白相對表達均高于對照組，并表現為逐漸增加的趨勢。

TNNI3K是一種心肌特異表達蛋白，屬于MAPKKK家族[7]，它包含3個蛋白結構域，其中C端1個蛋白激酶結構域和1個酪氨酸激酶結構域，N端為7個錨蛋白重復(ankyrin repeat)結構域。TNNI3K的結構和基因序列與整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)相似。ILK參與信號分子從細胞膜到細胞內的傳遞，并且在心臟生長、收縮和功能修復中起重要作用[8-9]。因為相似序列和結構的基因具有相似的功能，所以推斷TNNI3K可促進心臟生長和增強心肌收縮。另外，以C端序列構建的誘餌質粒，進行酵母雙雜交，表明TNNI3K與cTnI、心肌肌動蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調節(jié)蛋白發(fā)生相互作用[10]。新近的研究[11]證實，TNNI3K通過調節(jié)cTnI磷酸化促進心臟重塑，TNNI3K基因表達導致心臟向心性肥大，在TNNI3K轉基因實驗鼠中，向心性肥大保持在12個月以上并且左心室功能仍然正常，表明TNNI3K的超表達在一定時期導致代償性心肌肥厚而不是失代償的心肌肥厚。此外，TNNI3K基因在擴張性心肌病患者的心臟組織中表達比正常人超出6倍[12]。在急性心肌梗死患者的血液中cTnI水平增加，TNNI3K可通過對cTnI的調節(jié)增加心肌收縮力，從而發(fā)揮心臟保護作用[13]。

綜上所述，TNNI3K可通過與肌小節(jié)內的關鍵蛋白相互作用，促進心臟生長，增加心肌收縮力，從而在一定程度上起到心臟保護作用。然而，TNNI3K表達水平的進一步增加是否將會導致心肌失代償性肥厚？在心肌肥厚的進展過程中，TNNI3K對cTnI的調節(jié)是否起到關鍵作用？TNNI3K又是通過何種途徑調節(jié)cTnI的？仍需進一步的研究證實。

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(本文編輯：趙麗潔)

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CORRELATIONOFGENETNNI3KEXPRESSIONWITHMORPHOLOGICCHANGESOFCARDIACHYPERTROPHY

YANGDong1,WANGQie2,MILiguo2*，ZHANGYu3
(1.DepartmentofEmergency，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China;2.DepartmentofHumanAnatomy，theBasicMedicalCollegeofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China;3.TheSecondDepartmentofGeratology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTostudytherelationshipbetweencardiachypetrophyandgeneTNNI3Kexpressionbyobservingthemorphologicchangesduringthepressureoverloadhypetrophy.MethodsCardiachypertrophymodelsweremadethroughpartialligationofabdominalaorta.ThesectionsoftheventriclesampleswereusedforHEstainingorimmunohistochemicalstaining,thenobservedbylightmicroscope.Themixtureof3%paraformaldehydeand1%glutaraldehydewasusedinordertofixtheleftventriclesamplesfortransmissionelectronmicroscope.TherelativemRNAcontentofsamplesweremeasuredbyRT-PCRusingGAPDHasinnerstandard.ResultsThemyocardialcellsofcontrolgroupsarrangedtidilyandthenucleuswereclearunderthelightmicroscope.ThearrangementofthemyocardialcellsoftheMod4Wgroupbecametangly.Furthermore，thespaceamongthecellsbecamewider,andthefibrosiscouldbeobservedinextracellularmatrix.ThemyocardialhypotrophyoftheMod6WgroupwasmoreaggravatingthanthatoftheMod4Wgroup.Thefibrosiswashigh.Themitochondrialcristabecamethickerandconcentratedthanthatoftheothergroups.Thediedmyocardialcellcouldbeobserved.Alongwiththedevelopmentofthecardiachypetrophy,TNNI3Kgeneexpressiongraduallyincreased.ConclusionAlongwiththedevelopmentofthecardiachypetrophy,TNNI3Kexpressiongraduallyincreased.TheTNNI3Kinvolvedinthedevelopmentofcardiomyocyteshypertrophy.

cardiomyopathy,hypertrophic;geneexpression;rats

2014-03-20；

2014-07-10

楊冬(1981-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事急診科疾病診治研究。

R542.2

A

1007-3205(2014)11-1241-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.001

*通訊作者