程仕偉1，孫少華1，張 盈1，陶春彥1，朱 琳1，姜國正

(1．魯東大學生命科學學院應(yīng)用微生物研究所，山東 煙臺 264025；2. 煙臺恒源生物股份有限公司，山東 煙臺 265709)

殼聚糖是由2-氨基-D-葡萄糖和2-乙酰氨基-D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的多糖，與甲殼素、殼寡糖均被稱為甲殼素類物質(zhì)，被譽為繼糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等生命元素之外的第6大生命物質(zhì)[1]。殼聚糖經(jīng)降解后得到的殼寡糖與殼聚糖相比具有良好的水溶性，易被機體吸收，且具有許多獨特的生理活性[2]，其商業(yè)產(chǎn)品涉及功能性食品、藥品、環(huán)保、化工等多個領(lǐng)域[3-5]。殼寡糖的制備可采用化學法和酶降解法，通過化學方法降解殼聚糖制備殼寡糖的方法具有污染環(huán)境、產(chǎn)物不均一等缺點[6]。與常用的化學降解法相比，酶降解法生產(chǎn)殼寡糖的反應(yīng)條件溫和且易控制，產(chǎn)品得率高、功能性強，不會造成環(huán)境污染，是殼寡糖制備的主要方法[7-8]。

殼聚糖酶(Chitosanase, EC 3.2.1.132)是一類可專一性催化殼聚糖的β-1,4-糖苷鍵斷裂，制備低分子量殼寡糖的糖苷水解酶[9]，已發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶主要屬于糖基水解酶家族8、46 75、80等，廣泛存在于微生物中，在植物組織中也有分布[10]。殼聚糖酶根據(jù)其作用位點不同，可分為3類：1)水解 GlcN-GlcN 鍵及 GlcNAc-G1cN 鍵；2)只能水解 G1cN-GlcN 鍵；3)既可水解G1cN-GlcN 鍵又可水解 G1cN-GlcNAc 鍵。所有殼聚糖酶有一個共同催化性質(zhì)就是要求糖苷鍵的一側(cè)至少有1個G1cN 殘基，而不能催化 GlcNAc-G1cNAc鍵的斷裂[2, 11]。不同生物來源殼聚糖酶催化特性和酶解模式不同造成產(chǎn)物殼寡糖聚合度存在差異[12]。選育產(chǎn)殼聚糖酶的微生物菌株, 并優(yōu)化酶產(chǎn)量對合成不同聚合度產(chǎn)品具有積極意義。本文對研究室選育的產(chǎn)殼聚糖酶腸桿菌進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，旨在為殼聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌(Enterobactersp.)YT21，為本研究室從新鮮蝦皮組織中分離鑒定并保存。3, 5-二硝基水楊酸購自BBI公司，85%脫乙酰度的殼聚糖購自濟南海得貝生物工程有限公司，其余試劑均為分析純或生物純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器；SW-CJ-1B超凈工作臺，蘇州安泰；H1850R離心機，湖南湘儀實驗室儀器；HZQ-Q全溫搖床，哈爾濱東聯(lián)；SPX-250BS生化培養(yǎng)箱，上海新苗。

1.3 菌種活化

培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 5，酵母粉 3，蛋白胨 10，MgSO4.7H2O 2，pH 7.0。121 ℃滅菌15 min，將斜面保藏菌種挑一環(huán)轉(zhuǎn)接50 mL滅菌培養(yǎng)基，在30 ℃和200 r/min下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶，培養(yǎng)基組分(g/L)：葡萄糖 12、 酵母粉 8、 KCl 4、粉末殼聚糖 0.5、 NH4Cl 8、 MgSO4·7H2O 4、 MnSO44、 NaCl 2、粉末殼聚糖 0.5、pH 7.0。在不同溫度、pH和接種量條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)36 h后測定殼聚糖酶活力。

1.5 響應(yīng)面分析優(yōu)化

根據(jù)單因素優(yōu)化的結(jié)果，利用Design-Expert軟件分別對培養(yǎng)溫度、pH和接種量這3個因素進行Box-Benhnken試驗設(shè)計。設(shè)計17個試驗組，其中中心點試驗5次用于估計試驗誤差，其余組為析因組。以殼聚糖酶活性為響應(yīng)值，確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.6 殼聚糖酶活性測定

發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取適當稀釋度的上清液1 mL，加入1 mL的1% (m/V) 底物水浴(40 ℃)保溫20 min，加DNS試劑3 mL，沸水浴5 min，定容至25 mL后取4 mL反應(yīng)樣液在5000 r/min下離心10 min。取離心后上清液以對照組作為空白在520 nm處測定OD值，根據(jù)DNS標準曲線，計算其酶活力?？瞻讓φ战M：相同稀釋度的發(fā)酵上清液1 mL，沸水浴5 min滅活，再加入相同體積的殼聚糖溶液和DNS，處理方法同樣品組。以單位體積(mL)單位時間(min)水解產(chǎn)生的氨基葡萄糖的μmol數(shù)為酶活力的定義單位[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化培養(yǎng)基，產(chǎn)殼聚糖酶的腸桿菌在pH 7.0、4% (V/V)接種量和200 r/min條件下，考察培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響，發(fā)酵36 h后測定酶活力，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，菌株在28～35 ℃的溫度區(qū)間均有較好的產(chǎn)殼聚糖酶能力，最佳培養(yǎng)溫度為32 ℃，產(chǎn)酶量為7.32 U/mL。當溫度低于28 ℃時，菌體生長緩慢導致殼聚糖酶的產(chǎn)量低。相反的，當溫度高于35 ℃時，菌體生長過快而導致酶產(chǎn)量較低。

圖1 溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

2.2 培養(yǎng)pH對菌株產(chǎn)酶的影響

在4% (V/V)接種量、32℃和200 r/min條件下，研究pH對腸桿菌YT21產(chǎn)殼聚糖酶的影響，發(fā)酵36 h后測定酶活力，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，菌株對pH的適應(yīng)性較強，在pH 5.5～7.5區(qū)間均有較好的殼聚糖酶生產(chǎn)能力，其中在pH 6.0時獲得最大產(chǎn)酶量，活性值為8.22 U/mL。當培養(yǎng)基pH低于5.5或高于7.5時均不利于殼聚糖酶的分泌表達。

圖2 pH對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

在pH 6.0、32 ℃和200 r/min條件下，研究接種量對腸桿菌YT21產(chǎn)殼聚糖酶的影響，發(fā)酵36 h后測定酶活力。由圖3可以看出，菌株在6%～12% (V/V)的接種量時獲得較大的酶活性，其中8% (V/V)接種量時獲得最大殼聚糖酶活性，為10.73 U/mL。當接種量低于6%時，由于接種量不足導致發(fā)酵時間延長從而殼聚糖酶活力低。由圖3還可看出，當接種量高于8%時，發(fā)酵測定的酶活力變化不大，顯示最佳接種量為8%。

圖3 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

2.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化

根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，對培養(yǎng)溫度、pH和接種量進行Box-Benhnken試驗設(shè)計[14]，因素水平編碼見表1。將培養(yǎng)溫度(A)、pH(B)和接種量(C)3個因素作為自變量，以殼聚糖酶活性(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計17個響應(yīng)面分析實驗，其中5個為中心試驗，響應(yīng)面實驗結(jié)果與設(shè)計如表2所示。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果

采用DesignExpert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果見表3。培養(yǎng)溫度(A)、pH(B)和接種量(C)的二次多項回歸方程為：殼聚糖酶活性(U/mL) =11.69 + 0.05A+ 1.30B- 1.24C-0.18AB+ 0.62AC+ 0.02BC-2.07A2+0.42B2-1.71C2，其中一次項B、C極顯著(P< 0.01)，二次項A2、C2極顯著(P< 0.01)(表3)。

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

注：差異顯著(P< 0.05)；差異極顯著(P< 0.01)。

根據(jù)表3可以得出，回歸模型的F=7.58，其P=0.007，表明該模型極為顯著，決定系數(shù)R2=0.907 0，表明回歸模型與實際情況擬合性良好，可以用于發(fā)酵條件優(yōu)化。失擬項P=0.1189>0.05，即模型失擬不顯著，說明該方程可以很好地描述各發(fā)酵條件和殼聚糖酶活性的關(guān)系。各項P值小于0.05時，說明其對模型作用顯著，由P值大小可知，在所選各因素水平范圍內(nèi)，對發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的影響大小分別為培養(yǎng)pH>接種量>培養(yǎng)溫度。信噪比>4是可取的，本模型中為9.655，模擬效果較好。

圖4 培養(yǎng)溫度和pH交互作用對殼聚糖酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用軟件做培養(yǎng)溫度、pH和接種量對殼聚糖酶活性產(chǎn)生影響的響應(yīng)面圖(分別見圖4、圖5和圖6)，以分析2個因素的交互作用對殼聚糖酶活性的影響。根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度31.74 ℃、pH 6.5和接種量為7.26% (V/V)，模型模擬的理論殼聚糖酶最高活性值為13.65 U/mL。

圖5 培養(yǎng)溫度和接種量交互作用對殼聚糖酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

圖6 培養(yǎng)pH和接種量交互作用對纖維素酶活性影響的響應(yīng)曲面圖

2.5 回歸模型驗證與發(fā)酵培養(yǎng)曲線

為檢驗方法的可靠性，采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件進行腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶實驗，其培養(yǎng)曲線見圖7。

圖7 菌株發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)曲線

發(fā)酵36 h后實際得到的殼聚糖酶活性值為13.59 U/mL，實際值與預測值之間的誤差約為0.43%。因此采用響應(yīng)面優(yōu)化腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶條件可靠，具有實用價值。由圖7可看出，殼聚糖酶產(chǎn)量與菌體量呈現(xiàn)不完全對應(yīng)關(guān)系，最大生物量出現(xiàn)在發(fā)酵30 h，隨后經(jīng)短暫靜止期后進入衰退期。腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶屬于部分生長耦聯(lián)型(延續(xù)合成型)， 即酶的合成隨著細胞生長量的增加而增加， 在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長時間，在發(fā)酵48 h時獲得最大殼聚糖酶活性，為17.82 U/mL。綜上可判定，該酶為誘導酶，一般不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏，所對應(yīng)的mRNA相對穩(wěn)定，屬于理想的產(chǎn)酶類型，具有深入研究的潛力。

3 結(jié)論

首先對腸桿菌YT21發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)溫度、pH和接種量進行優(yōu)化，確立中心位點后進行響應(yīng)面設(shè)計分析，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度31.74℃、pH6.5和7.26%(V/V)接種量，培養(yǎng)48h獲得的最大殼聚糖酶活性為17.82U/mL，殼聚糖酶的生產(chǎn)方式為延續(xù)合成型，具有深入優(yōu)化并規(guī)模生產(chǎn)的潛力，相關(guān)酶學特性與深入優(yōu)化研究正在進行。

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