鄧向濤

HPLC法測定連錢草中熊果酸和齊墩果酸的含量

鄧向濤

目的 建立高效液相色譜法(HPLC法)測定連錢草中熊果酸和齊墩果酸含量的方法。方法 依利特C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)為色譜柱, 甲醇- 0.05 M磷酸二氫鈉溶液(87:13)為流動相, 流速1.0 ml/min, 檢測波長210 nm。結(jié)果 熊果酸在0.55~5.45 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9993), 平均回收率98.32%(RSD=1.74%)；齊墩果酸在0.22~2.19 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996), 平均回收率99.86%(RSD=1.84%)。結(jié)論 HPLC法簡便準(zhǔn)確, 可為連錢草的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

連錢草；熊果酸；齊墩果酸；高效液相色譜法

連錢草為唇形科植物活血丹的干燥地上部分, 具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫的功效。對于連錢草的質(zhì)量控制,《中華人民共和國藥典》(2010年版)主要通過木犀草素的薄層色譜來鑒別真?zhèn)? 通過測定醇溶性浸出物的含量來控制藥材質(zhì)量, 并未見具體化學(xué)成分的含量測定。三萜酸類為連錢草主要有效成分, 其中熊果酸具有抑制血管生成、抗腫瘤、抗炎等作用；齊墩果酸具有保肝、消炎、降糖等作用。本文以熊果酸和齊墩果酸為指標(biāo), 采用高效液相色譜法同時測定二者的含量, 為該藥材的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

島津LC-10A型高效液相色譜儀。熊果酸對照品(含量測定用, 批號：110742-200212), 齊墩果酸對照品(含量測定用, 批號：110709-200505), 均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純, 水為純化水, 其他試劑均為分析純。連錢草藥材來源于河南、湖北、江蘇等地, 經(jīng)鑒定均為唇形科植物活血丹的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 熊果酸、齊墩果酸對照品干燥至恒重, 分別精密稱取5.45 mg、2.19 mg, 置于10 ml容量瓶中,加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度, 搖勻即得。對照品溶液中熊果酸濃度為0.545 mg/ml, 齊墩果酸濃度為0.219 mg/ml。

2.1.2 供試品溶液的制備 取連錢草樣品約2.0 g, 置于平底燒瓶中, 加入甲醇25 ml密塞稱重, 加熱回流提取30 min放冷,稱定后以甲醇補(bǔ)足減失的重量, 搖勻后濾過, 棄去初濾液,取續(xù)濾液12.5 ml蒸干, 殘渣加無水乙醇-氯仿(3:2)混合液溶解并定容至10 ml量瓶中, 搖勻, 微孔濾膜(0.45 μm)過濾,濾液作為供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：大連依利特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：甲醇- 0.05 m磷酸二氫鈉溶液(87:13)；流速：1.0 ml/min；檢測波長210 nm。理論塔板數(shù)以熊果酸和齊墩果酸峰計均不低于4000。

2.3 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10 μl, 分別注入高效液相色譜儀, 以色譜峰面積(μV·s)為縱坐標(biāo)(Y軸), 以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X軸), 進(jìn)行線性擬合并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熊果酸的回歸線性方程為Y=366131 X-9288 r=0.9993；齊墩果酸的回歸線性方程為Y=428589 X-50454, r=0.9996。結(jié)果表明：熊果酸進(jìn)樣量在0.55~5.45 μg, 齊墩果酸進(jìn)樣量在0.22~2.19 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗 準(zhǔn)確吸取對照品溶液8 μl, 重復(fù)進(jìn)樣測定5次, 計算各峰面積的RSD。熊果酸峰面積的RSD為1.92%,齊墩果酸峰面積的RSD為2.51%, 結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確吸取供試品溶液15 μl, 分別于0、3、6、9、12 h進(jìn)樣, 計算各峰面積的RSD。熊果酸峰面積的RSD為1.74%；齊墩果酸峰面積的RSD為2.13%, 結(jié)果表明所測組分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批連錢草樣品, 共5份, 制備供試品溶液, 進(jìn)樣測定, 外標(biāo)法計算熊果酸和齊墩果酸的含量,結(jié)果二者的RSD分別為2.09%和2.60%, 表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取同一批已知含量連錢草樣品, 共6份, 每份約1.0 g, 分別加入適量的對照品, 制備供試品溶液, 測定含量并計算回收率。結(jié)果熊果酸的平均加樣回收率為98.32%, RSD為1.74%；齊墩果酸的平均加樣回收率為99.86%, RSD為1.84%。

2.8 樣品含量測定 取不同產(chǎn)地連錢草樣品, 制備供試品溶液, 分別精密吸取對照品溶液4 μl、樣品溶液15 μl, 注入高效液相色譜儀, 外標(biāo)法計算熊果酸和齊墩果酸的含量。結(jié)果見表1。

表1 連錢草樣品熊果酸和齊墩果酸含量測定結(jié)果

3 討論

同一產(chǎn)地連錢草樣品中, 熊果酸的含量遠(yuǎn)高于齊墩果酸；不同產(chǎn)地連錢草中, 熊果酸和齊墩果酸的含量存在較大差異, 同一省份含量略接近。結(jié)果表明連錢草藥材的質(zhì)量與生長環(huán)境、栽培方法、采集時間及存放時間等因素關(guān)系密切。

2014-06-25］

450003 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院