劉陽 林全德 劉玉章 趙俊梅 王超 喻鳳寬 張龑莉 李玉富 房佰俊

·論著·

NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者中血漿EB病毒含量檢測及其臨床意義

劉陽 林全德 劉玉章 趙俊梅 王超 喻鳳寬 張龑莉 李玉富 房佰俊

目的 探討外周血中EB病毒檢測在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的預(yù)后意義。方法 統(tǒng)計(jì)本院治療的結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者56例，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血中游離EBV-DNA拷貝數(shù)，將血漿EBA/DNA含量檢測>0 copies/ml為陽性，分別比較陽性組患者和陰性組患者在疾病分期、B癥狀以及療效之間的差異。結(jié)果 45例陽性患者中有29例(64.4%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，11例陰性患者中3例(27.3%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽性組中伴有B癥狀者27例，明顯高于陰性組患者的2例(P<0.01)。陽性組患者中達(dá)CR者17例(37.8%)，低于陰性組患者中達(dá)CR者8例(72.3%)，兩組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陽性組患者在3年無病生存率及總生存率方面均低于陰性組(3年無病生存率42.2% VS 72.7%，總生存率48.9% VS 81.8%，P<0.05)。結(jié)論 NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血中EB病毒檢測具有一定的預(yù)后指導(dǎo)意義。

NK/T細(xì)胞淋巴瘤；血漿；EB病毒檢測

目前研究發(fā)現(xiàn)NK/T細(xì)胞淋巴瘤與EB病毒感染關(guān)系密切，尤其是鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例，80%～100%都存在EB病毒感染[1]。有研究顯示，血漿EBV-DNA滴度與疾病的侵襲有關(guān)，可以作為一種腫瘤負(fù)荷標(biāo)記，從而對(duì)預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義[2]。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血中游離EBV-DNA拷貝數(shù)，分析其在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月～2010年1月在本科治療的經(jīng)病理及免疫組化證實(shí)的56例結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者。其中男性38例，女性18例，中位年齡34歲(14～67歲)；年齡<60歲者49例，≥60歲者7例；伴隨B癥狀者17例，無B癥狀者39例，IPI(國際預(yù)后指數(shù) IPI) 0～1分者16例，≥2分者38例。對(duì)于每位患者治療前、每化療兩周期后、治療結(jié)束后均進(jìn)行外周血EBV-DNA檢測。

1.2 試劑和儀器 DNA濃縮液、DNA提取液、EBV基因擴(kuò)增試劑盒購自德國Qiaqen公司，7300定量PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 樣本DNA提取 抽取患者2 ml外周血于EDTA抗凝管中，1500 r/min離心后分離上層血漿，取100 μl血漿，用QIA amp Blood Kit試劑盒提取血漿DNA，操作方法按說明書進(jìn)行。

1.3.2 引物及探針的設(shè)計(jì)及合成 所擴(kuò)增的目的基因來自EB病毒的BamH1-W片段。上、下游引物分別為：W-44F(5’-AGTCTCTGCCTCCAGGCA-3’)和W-119R(5’-ACAGAGCGCC TGTCC ACCG -3’)。在該P(yáng)CR反應(yīng)體系中加入一個(gè)雙末端標(biāo)記的熒光探針，探針的序列為[5’-(FAM)CACTG TCTGT AAAGT CCAGG CTCC(TAMRA)-3’]。上述引物和探針序列資料采集自Gen Bank序列數(shù)據(jù)庫。β-actin作為本實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。熱循環(huán)參數(shù)：93℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)。采用美國ABI-7300實(shí)時(shí)FQ-PCR儀進(jìn)行檢測，檢測步驟、結(jié)果判斷以及質(zhì)量控制方法按操作說明進(jìn)行。

1.3.3 反應(yīng)體系組成 PCR反應(yīng)總體積為50 μl，含有10 ml PCR緩沖液，引物和對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記探針各10 pmol，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各200 μmol/L，Taq聚合酶5U，DNA模版5 μl，吸取提取的DNA5 μl入PCR反應(yīng)管中。擴(kuò)增在自動(dòng)熒光PCR儀上進(jìn)行。

1.3.4 對(duì)照選擇 每批PCR反應(yīng)用雙蒸水作陰性對(duì)照，克隆合成的EB病毒W(wǎng)片段作為陽性對(duì)照，并稀釋成不同濃度梯度(106、105、104、103、102拷貝/μl)進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.5 血漿中EBA-DNA含量計(jì)算 血漿EB病毒DNA拷貝數(shù)C=Q×(VDNA/VPCR) ×(1/Vext)，其中C為血漿中待測DNA拷貝數(shù)(拷貝/ml)，Q為PCR擴(kuò)增后計(jì)算機(jī)檢測的原始DNA拷貝數(shù)，VDNA為提取的DNA稀釋液體積，VPCR為用于PCR擴(kuò)增的DNA體積，Vext為用于提取DNA的血漿體積。血漿EBA/DNA含量檢測>0 copies/ml為陽性。

1.3.6 治療 兩組患者均給予均采用標(biāo)準(zhǔn)的DICE聯(lián)合L-ASP方案化療6～8周期：異環(huán)磷酰胺1200 mg/m2，第1～3天，靜脈滴注；足葉乙甙65 mg/m2，第1～4天，靜脈滴注；順鉑25 mg/m2，第1～3天，靜脈滴注；地塞米松40 mg，第1～4天，靜脈滴注；L-ASP 7000U/m2，第6～10天，每21天為1個(gè)周期，化療前后查血常規(guī)、肝腎功能、心電圖、CT、彩超等常規(guī)檢查。常規(guī)化療結(jié)束后所有患者均采取三維適形放療(3D-CRT)，仰臥位下熱塑料面罩固定，CT模擬定位，掃描圖像經(jīng)局域網(wǎng)傳至三維計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行重建，計(jì)劃設(shè)計(jì)、計(jì)算和評(píng)估。放射源采用6 mVX線。中位照射劑量為45Gy(38～50Gy)，采用常規(guī)分割2Gy/d，5次/周。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用分析軟件包SPSS 17.0進(jìn)行分析。多組間及兩組間EBV-DNA拷貝數(shù)比較分別采用非參數(shù)樣本檢驗(yàn)，組間EBV/DNA陽性率的比較采用卡方檢驗(yàn)，組間生存率比較用Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用稀釋成不同濃度的陽性對(duì)照在擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)過程中，每8S實(shí)時(shí)檢測一次產(chǎn)物量，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，得出PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線及熒光定量CPR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 結(jié)果 56例患者中陽性患者45例(80.3%)，陰性患者11例(19.7%)，陽性患者外周血EBV-DNA中位拷貝數(shù)為2.4×104copies/ml(7.1×102～2.8×105copies/ml)，45例陽性患者中有29例(64.4%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，11例陰性患者中3例(27.3%)為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽性患者中伴有B癥狀者27例(60%)，明顯高于陰性患者中2例(18.2%)伴有B癥狀者(P<0.01)。在完全緩解率(CR)方面，陽性組患者中達(dá)CR者17例(37.8%)，低于陰性組患者中達(dá)CR者8例(72.3%)，兩組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。陽性組患者3年無病生存者19例(42.2%)，而陰性組患者中為8例(72.7%)，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差意義，在3年總生存率比較方面，陽性組(48.9%)低于陰性組的81.8%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組患者檢測情況及療效比較

3 討論

結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤是常發(fā)生于亞洲和南美洲，尤其是中國西南比較常見的結(jié)外淋巴瘤，其發(fā)病率約占所診斷淋巴瘤的10%[3]，可能與中國EB病毒感染發(fā)病率較高有一定的關(guān)系[4]。NK/T細(xì)胞淋巴瘤的臨床病理特征是EB病毒的表達(dá)和NK細(xì)胞(CD56)及T細(xì)胞(細(xì)胞毒性分子)的表達(dá)[5,6]。早期病灶常局限于鼻腔或鼻咽部，目前病因不明，有文獻(xiàn)報(bào)道NK/T細(xì)胞淋巴瘤與EBV具有明顯的相關(guān)性[7]，EBER陽性率可達(dá)80%～90%，此相關(guān)性無種族差異[8-10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展及淋巴瘤發(fā)病機(jī)制及預(yù)后研究進(jìn)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EB病毒在NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起到了重要作用，Suzuki等研究報(bào)道，NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者EBV檢測陽性率達(dá)90%以上，通過定量檢測患者血清中EBV-DNA發(fā)現(xiàn)，DNA拷貝數(shù)高者臨床分期較拷貝數(shù)低者增高，預(yù)后差，提示EBV-DNA檢測可作為判斷NK/T細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[11]。也有研究報(bào)道在患者血清中可檢測出高水平的EB病毒DNA拷貝數(shù)，并且隨著治療有效而下降，治療無效而升高，可以作為判斷NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后因素之一[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，56例鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者中EBA/DNA陽性者達(dá)45例，占所有患者的80.3%，與報(bào)道符合。而外周血游離EBV DNA陽性者往往臨床分期較晚，多為Ⅲ/Ⅳ期患者，且隨著臨床分期進(jìn)展，拷貝數(shù)有上升趨勢，伴有B癥狀者拷貝數(shù)明顯高于無B癥狀者(P<0.05)，并且較高的拷貝數(shù)患者有著較差的治療效果。本研究病例有限，下一步擬擴(kuò)大研究例數(shù)，并且動(dòng)態(tài)檢測EBA/DNA拷貝數(shù)，包括治療前、治療中以及治療后監(jiān)測，同時(shí)根據(jù)檢測結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后分層，建立個(gè)體化治療策略，以進(jìn)一步提高鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤的療效。

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Clinical significance of plasma EB virus determination in NK/T cell lymphoma patients

LIUYang,LINQuan-de,LIUYu-zhang,etal.

DepartmentofHematology,AffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China

Objective To evaluate the prognostic significance of EB virus detection in peripheral blood in NK/T cell lymphoma patients. Methods There were 56 patients with extranodal nasal type NK/T cell lymphoma

therapy in our hospital, the EBV-DNA were detected with fluorescence quantitative PCR in the peripheral blood, it was positive that the plasma EBA/DNA content detection of >0 copies/ml, the differentiation about stage of disease, B symptoms as well as the curative effect between positive group and negative group patients was analyzed respectively. Results There were 29 patients (64.4%) with advanced (stage Ⅲ/Ⅳ) for 45 cases positive patients, and 3 patients (27.3%) with advanced (stage Ⅲ/Ⅳ) for 11 cases negative patients, there was significant difference between two groups (P<0.01),27 cases with B symptoms in positive group was significantly higher than 2 cases in negative group patients (P<0.01).There were 17 cases reach CR (37.8%) in positive group, which was lower than 8 cases in negative group. (72.3%).The 3 years disease free survival rate and overall survival rate of patienrs in the positive group was significantly lower than the negative group patients. Conclusion It will be a prognostic factor that to detect EB virus in peripheral blood of patients with NK/T cell lymphoma.

NK/T cell lymphoma；Plasma；EB virus detection

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目社會(huì)預(yù)研專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：20120091007)

450008鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科/河南省腫瘤醫(yī)院血液科

房佰俊 E-mail：fdation@126.com