許沈南 李佳杰 盧旭生 張偉亮

膽總管囊腫患者與巨細胞病毒感染關(guān)系的相關(guān)性

許沈南 李佳杰 盧旭生 張偉亮

目的 探索人巨細胞病毒感染與膽總管囊腫的相關(guān)性。方法 使用人巨細胞病毒熒光定量PCR分別對25例膽總管囊腫和20例對照組患者肝臟組織進行檢測, 同時進行病理染色和人巨細胞病毒晚期蛋白免疫組化檢測。結(jié)果 對照組均為檢測到陽性結(jié)果, 實驗組中, 人巨細胞病毒陽性14例(陽性率56%)。免疫組化結(jié)果顯示陽性蛋白多位于肝細胞﹑血管內(nèi)皮細胞﹑炎癥浸潤細胞當(dāng)中, 膽管上皮細胞呈強陽性反應(yīng)。結(jié)論 膽總管囊腫與人巨細胞病毒感染之間存在密切相關(guān)性。

巨細胞病毒感染；膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst, CCC)是一種伴有膽汁淤積的外科膽道疾病, 是膽道系統(tǒng)常見先天畸形［1］。小兒膽總管囊腫穿孔在小兒時期很少見, 一旦出現(xiàn)則病情重, 早期診斷較困難, 其發(fā)病機理至今尚不清楚。在臨床診治中發(fā)現(xiàn)巨細胞病毒(cytomegalo virus)與穿孔有一定的關(guān)聯(lián)［2］, 相關(guān)實驗也提示該病與人巨細胞病毒感染之間存在相關(guān)性。因此本實驗對膽總管囊腫患者及對照組患者肝臟組織中的人巨細胞病毒進行檢測, 為檢驗和論證膽總管囊腫與人巨細胞病毒感染之間的相關(guān)性問題提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新鮮肝臟組織標本源自普寧市人民醫(yī)院2010年～2013年施行手術(shù)的25例膽總管囊腫患者, 其中男13例,女12例。全部病例手術(shù)時年齡在2～8歲, 平均(4±2)歲。同時收集對照組病例20例, 均來自于本院意外死亡尸檢小兒。

1.2 方法 全部行B超及CT檢測, 診斷為膽總管囊腫, 手術(shù)中進一步探查, 證實為膽總管囊腫。術(shù)中切取直徑約1 cm的肝右葉邊緣組織, 分成兩份, 一份用甲醛固定, 另一份于-80℃超低溫冰箱中保存。

2 主要試劑及設(shè)備

DNA提取試采用 QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit,人巨細胞病毒檢測使用中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸擴增熒光定量檢測試劑盒, HCMV 晚期蛋白PP65單克隆抗體購自美國 USCNLIFE 公司, 為兔抗人單克隆抗體,其余免疫組化試劑均購自DAKO公司。

3 熒光定量PCR

取約40 mg的肝臟標本提取DNA, 提取過程嚴格按照QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit操作說明書進行。熒光定量PCR反應(yīng)條件及結(jié)果判定均按照相應(yīng)的試劑盒說明書進行, 反應(yīng)結(jié)束后使用7300 system SDS software進行數(shù)據(jù)處理與分析。具有反應(yīng)條件, 詳見表1。

表1 5種病毒FQ-PCR反應(yīng)條件

4 病理及免疫組織化學(xué)染色

肝臟組織使用甲醛固定后, 包埋成石蠟塊并進行切片。病理染色方法包括HE 染色和MASSON染色。于此同時, 采用二步法對人巨細胞病毒晚期蛋白PP65進行免疫組織化學(xué)染色, 以包漿內(nèi)有明顯棕黃色為陽性。

5 結(jié)果

5.1 人巨細胞病毒在膽總管囊腫組織中的感染率 PCR結(jié)果顯示：25例膽總管囊腫患者肝臟組織中, HCMV陽性者14例子, 陽性率56%, 對照組20例HCMV均為陰性。

5.2 膽總管囊腫組織病理變化 膽總管囊腫患者肝臟組織病理結(jié)果顯示：肝小葉有不同程度的變性壞死, 部分可見肝多核巨細胞, 匯管區(qū)膽栓形成, 膽小管增生, 膽道上皮細胞變性。以膽小管為中心, 炎癥細胞侵潤, 不同程度的纖維束包裹膽小管。詳見圖1。

圖1 膽總管囊腫膽管及肝細胞病理學(xué)染色(400×)

5.3 膽總管囊腫組織PP65分布情況 PCR檢測HCMV檢測陽性者, PP65免疫組化染色可見：PP65 均位于感染細胞胞漿當(dāng)中, 陽性細胞多較集中分布于肝細胞﹑血管內(nèi)皮細胞﹑膽管上皮細胞和炎性浸潤細胞, 膽道上皮細胞呈強陽性表達。詳見圖2。

圖2 膽總管囊腫患者肝臟組織PP65免疫組化染色

6 討論

CMV是一種DNA病毒。HCMV是人體最常見的機會性感染病毒之一。用檢測方法調(diào)查HCMV感染率, 發(fā)達國家人群感染率40%～60%, 發(fā)展中國家95%～99%。近年來, 隨著研究的深入, 很多學(xué)者已認識到膽總管囊腫不能簡單歸于先天性疾病, 而更可能是圍生期的一種進行性病變。其明顯的季節(jié)和地區(qū)聚集趨勢的特點提示該病可能與環(huán)境中某種感染因素的損傷有關(guān)［2］。隨后相關(guān)的研究也表明病毒感染與膽總管囊腫存在相關(guān)性［3］。

但具體是哪一種病毒卻值得探索, 近年來人們采用多種方法對膽總管囊腫和多種病毒感染之間的相關(guān)性問題進行研究, 相關(guān)研究也證實該病與多種病毒之間存在相關(guān)性, 其中主要病毒包括呼腸病毒﹑輪狀病毒和巨細胞病毒3大類［4-6］。

本實驗使用PCR方法直接檢測患者肝臟組織當(dāng)中HCMV的陽性率, 并使用尸檢患兒肝臟組織作為對照組, 實驗結(jié)果顯示膽總管囊腫患者的陽性率高達56%, 而對照組則未有陽性病例。此數(shù)據(jù)與國內(nèi)董永綏等［7］進行大規(guī)模前瞻性研究得出的普通嬰幼兒CMV肝炎發(fā)生率(42%)相比, 提示BA病因為HCMV感染的可能。進一步提示了膽總管囊腫與巨細胞病毒的相關(guān)性。

于此同時, 作者注意到膽總管囊腫患者的膽道上皮細胞上HCMV晚期蛋白PP65的表達呈強陽性, 且膽道上皮細胞亦出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示HCMV對膽總管囊腫患兒的膽道上皮細胞具有侵襲性, 可誘發(fā)膽道上皮細胞的凋亡, 從而影響膽小管的功能與結(jié)構(gòu)。

將通過動物學(xué)實驗進一步證實本次研究的檢測結(jié)果, 將HCMV打入到胎鼠當(dāng)中, 觀察其膽道的變化。HCMV與膽總管囊腫之間存在相關(guān)性, 可謂臨床上膽總管囊腫的防治提供科研依據(jù), 造福患兒。

［1］ Alford CA, Stagno S, Pass RF, Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis , 1990, 125Suppl7:S745-753.

［2］ Wu T C, Hruban R H, Ambinder R F, et al.Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts.The American journal of pathology, 1992, 140(3): 739.

［3］ 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實用兒科臨床雜志, 2007, 22( 23):1761-1763.

［4］ Szavay PO, Leonhardt J, Czech-Schmidt G, et al.The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia.Eur J Pediatr Surg, 2002, 12(4):48-50.

［5］ Bobo L, Ojeh C, Chiu D, et al.Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia.Pediatr Res, 1997, 41(2):229-234；

［6］ De Tommaso AM, Andrade PD, Costa SC, et al.High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extrahepatic neonatal cholestasis.BMC Infect Dis, 2005, 12(1):108；

［7］ 董永綏, 方峰, 魏晶, 等.巨細胞病毒感染的母嬰傳播研究.中國實用兒科雜志, 2000, 15(3): 334-335.

Correlation of congenital choledochal cyst and cytornegalovirus infection

XU Shen-nan, LI Jia-jie, LU Xu-sheng, et al.

Puning People's Hostpital, Puning 515300, China

Objective To explore the relationship between human cytomegalovirus and choledochal cyst.Methods Fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) was used to detect the liver tissue of human cytomegaloviru in 25 cases of choledochal cyst and 20 cases of control group.Meanwhile, immunohistochemistry was used to detect the human cytomegalovirus late proteins PP65 with the paraffin section.Results Among 25 cases of choledochal cyst, 14 cases (56%) were found to be positive for HCMV, meanwhile, the immunohistochemistry result showed that PP65 was located in the cytoplasm of infected cells such as liver cells, vascular endothelial cells, bile duct epithelial cells and inflammatory infiltrating cells.Conclusion HCMV has a close relationship with choledochal cyst.

Cytomegalovirus infection; Choledochal cyst

515300 廣東省普寧市人民醫(yī)院外二科