劉 暢李宛珊孫路路潘 健藍海濤

趙 昕1付 征1遠 庚1何 龍1齊文升1△

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.安徽省蚌埠市第一人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 001001）

·研究報告·

新加達原散體外延緩銅綠假單胞菌耐藥的實驗研究*

劉 暢1李宛珊1孫路路2潘 健1藍海濤1

趙 昕1付 征1遠 庚1何 龍1齊文升1△

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.安徽省蚌埠市第一人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 001001）

目的 探討新加達原散體外延緩銅綠假單胞菌耐藥的作用。方法 應用血清藥理學方法制備新加達原散含藥血清，模擬中藥口服吸收后的實際成分。采用含藥血清混合肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌ATCC27853，同時以低濃度左氧氟沙星誘導銅綠假單胞菌耐藥，對照組采用空白大鼠血清處理，同時設立不含血清的單純抗生素誘導組以除外血清本身的作用。即分為含藥血清組、空白血清組和空白對照組。隨后進行傳代培養(yǎng)，觀察每一代細菌生長及出現(xiàn)耐藥的情況，直至某一組產(chǎn)生細菌耐藥現(xiàn)象，紙片法測定3組細菌耐藥情況的差異，并測量每組的MIC值。結果 在體外誘導耐藥的過程中，誘導至第6代，空白血清組和空白對照組產(chǎn)生耐藥，誘導至第10代，含藥血清組產(chǎn)生耐藥。結論 新加達原散含藥血清體外可以延緩銅綠假單胞菌對左氧氟沙星耐藥性的產(chǎn)生。

新加達原散 銅綠假單胞菌 細菌耐藥

隨著臨床上廣譜抗生素的廣泛使用，細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重。銅綠假單胞菌感染的發(fā)病率、病死率處于較高水平，并且對超廣譜抗生素的敏感性不斷在下降［1］。多藥耐藥成了銅綠假單胞菌感染的一個嚴重問題，近年來更是出現(xiàn)了對除了多粘菌素外的所有抗假單胞菌的抗生素同時耐藥的菌株，即泛耐藥銅綠假單胞菌。除多粘菌素外目前市面上有售的抗生素對其完全無效，患者一旦感染，往往使臨床醫(yī)師束手無策，病死率極高，造成極其嚴重的后果［2-3］。中藥在抑制細菌耐藥方面取得了不少成果，主要是在單味藥和中藥單體的研究上較多。筆者臨床應用新加達原散聯(lián)合抗生素治療耐藥菌感染取得良好效果。本實驗以基于伏邪理論的清透法為處方原理，以新加達原散制成含藥血清，進行含藥血清對銅綠假單胞菌耐藥的體外實驗研究，現(xiàn)報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物 SD大鼠100只，清潔級，體質量（200±20）g，雌雄各半，購于中國食品藥品檢定研究院，合格證號：SCXK（京）2009-0017，在中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院動物房喂養(yǎng)。正常光照條件下，食、水自由攝取，室溫控制在18～22℃。

1.2 菌株 銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院檢驗科微生物室保存）。

1.3 藥物 新加達原散（青黛、草果、黃芩、蟬衣、柴胡等），由中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院藥劑科提供，配制成含生藥2 g/mL的煎劑，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。為保證不同批次中藥湯劑有效成分的一致性，由筆者所在醫(yī)院藥劑科對每批煎劑樣本進行指紋圖譜分析比照，保證中藥煎劑的一致性。鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（揚子江藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H20066291，100 mL，0.3 g）。

1.4 試劑與設備 左旋氧氟沙星藥敏紙片（藥敏紙片購自Oxoid公司，規(guī)格：直徑6mm，每片吸水量約20μL，5 μg/片）；M-H肉湯；M-H培養(yǎng)皿；營養(yǎng)瓊脂沉降菌培養(yǎng)皿（NA）。全自動微生物分析系統(tǒng)；加樣器；超凈工作臺；離心機；水浴鍋；溫箱；光電比濁儀；標準比濁管；96孔細胞培養(yǎng)板；加樣器；吸頭；止血鉗；手術剪；采血針；采血管；游標卡尺等。

2 方 法

2.1 含藥血清制備 將大鼠隨機分為2.5倍等效劑量灌胃組、空白對照組兩組。適應性喂養(yǎng)3 d后，分別予中藥或注射用水灌胃。2.5倍等效劑量組根據(jù)標準體質量成人每日用量折算為5 g/d［4］，將原液稀釋成1.25 g/mL，每日灌胃4 mL，分早晚兩次灌入；空白對照組以相同體積注射用水灌胃，共5 d，末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h腹主動脈無菌采血針取血［5］。取血1 h分層后，采血管于4℃恒溫冰箱放置1 h，然后離心機中3000 r/min離心15 min，取上層清液，同組血清分別混勻后，分裝于1 mL EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 營養(yǎng)肉湯制備 稱取37 g肉湯粉溶于1 L蒸餾水中，加熱至煮沸使其完全溶解，再用121℃、15 min高壓滅菌，將肉湯分裝于試管中，置于4℃冰箱無菌備用。

2.3 菌液制備 將銅綠假單胞菌ATCC27853接種于血培養(yǎng)平皿中，35℃溫箱孵育18～24 h，次日以無菌接種環(huán)取少量菌落于適量生理鹽水中，用比濁儀對照后，調整菌液濃度至1×108CFU/mL（0.5麥氏單位），置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 鹽酸左氧氟沙星對銅綠假單胞菌ATCC27853的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定在無菌條件下，用微量加樣器精確移取鹽酸左氧氟沙星注射液500 μL與滅菌注射用水671.875 μL混合稀釋至1280 μg/mL。在96孔板選取12孔，第1孔中加入上述稀釋后的左氧氟沙星溶液20 μL和營養(yǎng)肉湯180 μL，第2到第12孔中每孔加入100 μL營養(yǎng)肉湯。以加樣器混勻后由第1孔吸取100 μL混勻液至下一孔，繼續(xù)混勻進行2倍系列稀釋至第10孔，剩余混勻液棄去，使各孔左氧氟沙星最終質量濃度為128、64、 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，前11孔每孔分別加入配制好的菌液10 μL，第11孔作為陽性對照，第12孔作為陰性對照。以上操作后，放入35℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后取出，以小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為該抗菌藥物對銅綠假單胞菌的MIC值。測得MIC值后，在MIC濃度上下幾個稀釋度都取培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)基上，隔夜培養(yǎng)18～24 h后觀察是否有細菌生長，沒有細菌生長的最大藥物濃度為鹽酸左氧氟沙星對銅綠假單胞菌ATCC27853的MBC值。

2.5 K-B法對左氧氟沙星藥敏紙片對銅綠假單胞菌ATCC27853的抑菌環(huán)直徑的測定 采用紙片擴散法（K-B法），將0.5麥氏單位銅綠假單胞菌ATCC27853菌液密涂于4 mm厚的M-H培養(yǎng)皿上，中間貼左氧氟沙星藥敏紙片，35℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后游標卡尺量取抑菌環(huán)直徑。

2.6 低濃度鹽酸左氧氟沙星體外傳代誘導耐藥的測定 實驗分為以下3組。含藥血清組：含藥血清＋1/2 MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液?？瞻籽褰M：空白血清＋1/2MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液?？瞻讓φ战M：1/2MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液。

每組中每孔鹽酸左氧氟沙星最終質量濃度為1 μg/mL，血清添加量選擇為整個反應體系的20%，分別將0.5麥氏濁度的銅綠假單胞菌ATCC27853菌液10 μL接種于每孔中，培養(yǎng)18～24 h為1代后，分別由各孔中取適量菌液比濁后配制成0.5麥氏單位，分別接種于同組的第2孔中，記為第2代，如此重復傳代，并用傳代后的細菌做誘導耐藥實驗及K-B法測左氧氟沙星藥敏紙片對上一代細菌的抑菌環(huán)直徑，用肉湯稀釋法測左氧氟沙星對上一代細菌的MIC值，待抑菌直徑判斷為耐藥，且誘導后的MIC值≥4倍誘導前的MIC值，判斷誘導耐藥成功。將判斷為誘導成功的耐藥菌株繼續(xù)傳3代，每代均用K-B法檢測左氧氟沙星藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑，確定耐藥菌株的穩(wěn)定性，比較3組出現(xiàn)耐藥的先后順序及MIC值。

2.7 藥物敏感性標準判定 根據(jù)2009年臨床實驗室標準化研究室（CLSI）的執(zhí)行標準［6］判讀：左氧氟沙星MIC≥8 μg/mL為耐藥（R），4 μg/mL為中介（I），≤2 μg/mL為敏感（S）；藥敏紙片含5 μg藥物，抑菌直徑≤13 mm為耐藥（R），14～16 mm為中介（I），≥17 mm為敏感（S）。

3 結 果

3.1 左氧氟沙星對銅綠假單胞菌 ATCC27853的MIC、MBC值和抑菌圈直徑 倍比稀釋法測得鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液對銅綠假單胞菌ATCC27853的MIC值為2 μg/mL，MBC值為4 μg/mL；K-B法測定左氧氟沙星藥敏紙片對銅綠假單胞菌ATCC27853的抑菌圈直徑為24 mm。

3.2 低濃度鹽酸左氧氟沙星體外誘導銅綠假單胞菌ATCC27853耐藥的結果 在低濃度鹽酸左氧氟沙星體外傳代誘導銅綠假單胞菌耐藥的過程中，觀察每代銅綠假單胞菌菌株的生長狀態(tài)，含藥血清組肉眼可見細菌生長量明顯少于空白血清組和空白對照組；誘導至第6代，含藥血清組抑菌圈直徑（20.08±0.55）mm，空白血清組抑菌圈直徑（11.58±0.71）mm，空白對照組抑菌圈直徑（11.25±0.79）mm，空白血清組、空白對照組菌株抑菌環(huán)直徑＜13.00 mm，MIC值為16 μg/mL，對左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥，而含藥血清組耐藥性弱于空白血清、空白對照兩組；誘導至第10代，含藥血清組抑菌圈直徑（12.07±0.35）mm，MIC值為16 μg/mL，對左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥。提示新加達原散具有延緩低濃度左氧氟沙星環(huán)境下銅綠假單胞菌耐藥性產(chǎn)生的作用。見表1，表2。

表1 肉眼觀察PA ATCC27853各組傳代細菌生長情況結果

表2 PA ATCC27853傳代各組平均抑菌圈直徑（mm）

4 討 論

銅綠假單胞菌是院內獲得性感染的重要條件致病菌，可以引起嚴重的、甚至致死性的感染。隨著耐藥菌不斷出現(xiàn)，對現(xiàn)有抗生素不斷耐藥，研發(fā)新型抗生素不僅需要大量資金投入，同時需要很長的研發(fā)時間，而細菌耐藥菌株的出現(xiàn)卻日新月異，遠遠超過抗生素研發(fā)周期。目前從抗生素的不斷升級、種類的更新，到劑量增加、多類聯(lián)合，仍不能很好地控制耐藥菌感染，而對于耐藥菌的定植，則無從治療［7］。銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥是由多因素造成的。細菌產(chǎn)生滅活酶；細菌改變藥物作用的靶位結構；細菌細胞膜的通透性降低；主動外排作用；代謝途徑的改變之間可以發(fā)生協(xié)同作用；生物膜銅綠假單胞菌耐藥機制也是近年來的研究重點和熱點［8-9］。銅綠假單胞菌對不同抗生素的耐藥機制也不完全相同，可能還不斷有新的耐藥機制出現(xiàn)。因此臨床上銅綠假單胞菌出現(xiàn)多重耐藥、交叉耐藥的現(xiàn)象亟待解決。由抗生素應用引起的耐藥性問題，促使國內外醫(yī)藥界把注意力轉向具有抗菌活性的中草藥，不少研究顯示中藥不但具有抗菌活性，中藥復方的使用能加強抗菌活性甚至具有逆轉細菌耐藥的作用［10］。

中藥在抑制細菌耐藥方面有不少實驗報道。張淑文等［11-16］總結若干中藥對耐藥菌干預作用的研究，篩選出多種具有抑制細菌耐藥性的中藥組成復方清熱顆粒，并將其驗證于實驗及臨床，效果頗著。劉清泉等［17-20］也做過類似的研究，其根據(jù)中醫(yī)伏邪理論提出扶正透邪溫陽是中醫(yī)藥治療耐藥菌感染的治則，在耐藥菌感染治療上應用抗生素聯(lián)合扶正透邪方，臨床上取得良好的效果，并且在體內體外耐藥菌實驗及分子生物學實驗中證實中藥對細菌耐藥性的良性干預作用。

筆者在臨床觀察和治療耐藥菌感染中發(fā)現(xiàn)耐藥菌感染符合伏邪致病的特點，治療伏邪溫病，不可過用苦寒，當以清透為主，據(jù)此建立了以清透法為制方原理的新加達原散，聯(lián)合抗生素治療耐藥菌感染，在臨床治療中收效頗著。本實驗體外誘導耐藥模型的方法為低濃度抗生素微量肉湯稀釋傳代誘導法。實驗結果顯示含藥血清組出現(xiàn)耐藥的時間較空白血清組和空白對照組晚，提示在誘導劑左氧氟沙星的作用下，含藥血清的加入干預了銅綠假單胞菌的耐藥性，在一定程度上延緩銅綠假單胞菌出現(xiàn)耐藥的時間。該實驗最大限度地模擬了中西藥結合治療細菌感染的體內狀態(tài)。

耐藥菌感染患者多表現(xiàn)正氣虧虛，易受外邪侵襲，若治不得法，過用寒涼藥物、過早使用下法等，會導致邪氣不除，漸行入里，伏藏于內，伏久郁而化熱，遇時而發(fā)。故邪氣潛伏，必須透達。清透法的代表方劑為達原飲，吳又可在解釋方名時說“檳榔能消能散，除伏邪，為疏利之藥；厚樸破戾氣所結，草果辛烈氣雄，除伏邪盤踞；三味協(xié)力，直達其巢穴，使邪氣潰敗，速離膜原，是以為達原也”。因此伏邪理論獨特的清透法在臨床耐藥菌感染的治療中有著不可替代的療效價值。我科繼承蒲輔周、薛伯壽老中醫(yī)的經(jīng)驗，整合中醫(yī)治療傷寒、溫病的優(yōu)勢，在薛伯壽老中醫(yī)的指導下，在達原飲的基礎上加減組成新加達原散。該方是由達原飲、升降散、小柴胡湯加減化裁而來，以青黛解毒；乳香散癖結；草果外達潛伏之邪；黃芩、柴胡和解表里；蟬衣、酒軍升清降濁、調和紊亂之氣血。全方具有清熱涼血、解毒透邪之功效。

通過前述實驗結果，提示以清透法為制方原理的新加達原散含藥血清體外可以延緩銅綠假單胞菌對左氧氟沙星出現(xiàn)耐藥的時間，這無疑為中醫(yī)藥解決細菌耐藥這一棘手難題提供了思路。

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Study on Bacteriostasis of Pseudomonas Aeruginosa by Xinjiadayuan Decoction in Vitro

LIU Chang1，LI Wanshan2，SUN Lulu2，et al. 1 Guang′anmen Hospital，China Academy of Chinese Medicine Science，Beijing 100053，China；2 Bengbu First People's Hospital，Anhui Province，Anhui，Bengbu 001001，China

Objective：To study the role of inhibiting antibiotic resistance by Xinjiadayuan Decoction.Methods：Serum pharmacology method was applied to prepare drug serum to simulate the actual compounds after oral medicine absorbed.The pseudomonas aeruginosa ATCC27853 was cultured in broth medium with drug serum. Resistance of PA was induced by low concentration levofloxacin.Control group was treated by blank rat serum.At the same time，a group cultured PA in broth medium with simple antibiotics without serum was set up to remove the interference of serum itself.During subculture，culture of bacteria of each generation was observed until drug resistance occurred.Kirby-Bauer method was used to measure the antibiotic sensitivity and MIC was measured in each group.Results：In the process of induction of resistance in vitro，the blank serum group and blank control group were resistant in the sixth generation.While medicated serum group were resistant in the tenth generation. Conclusion：Serum containing Xinjiadayuan Decoction may delay the resistance of PA to levofloxacin.

Xinjiadayuan Decoction；Pseudomonas Aeruginosa；Bacterial resistance

R285.5

A

1004-745X（2014）11-2017-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.021

2014-07-23）

中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院科研課題項目（2009-S219）

△通信作者