李 穎宮麗鴻

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

·研究報(bào)告·

搜風(fēng)祛痰法對ApoE基因敲除小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)的影響*

李 穎1宮麗鴻2△

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

目的 通過觀察過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）的表達(dá)水平，來闡明搜風(fēng)祛痰法中藥對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的干預(yù)作用機(jī)制。方法 制備ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型，隨機(jī)分為5組：模型組、穩(wěn)斑湯低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥（他?。┙M，另設(shè)空白對照組。采用HE染色、Masson染色法用于實(shí)驗(yàn)觀察，應(yīng)用RT-PCR法檢測PPAR-γmRNA的表達(dá)。結(jié)果 與空白組、模型組相比，穩(wěn)斑湯各劑量組及西藥組PPAR-γ mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。結(jié)論 穩(wěn)斑湯可以提高PPAR-γmRNA表達(dá)水平，對小鼠動脈粥樣硬化有一定穩(wěn)定斑塊的效應(yīng)，因劑量不同而各異。

搜風(fēng)祛痰法 ApoE基因敲除 小鼠 動脈粥樣硬化 不穩(wěn)定斑塊 過氧化物酶體增殖物激活受體γ

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，也是臨床心腦血管疾病發(fā)生和引起死亡的主要原因。近年來患病人群有逐步年輕化趨勢，嚴(yán)重危害人類身體健康。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察搜風(fēng)祛痰法中藥對小鼠PPAR-γ mRNA表達(dá)的影響，以此來研究其對動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物造模及分組 選6～8周齡ApoE基因敲除小鼠70只，飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料13周后，隨機(jī)處死4只，取主動脈根部HE染色觀察，確定易損斑塊［1］的形成，造模成功。成模小鼠60只隨機(jī)分為5組每組12只：模型組、穩(wěn)斑湯低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥組。

1.2 藥物 穩(wěn)斑湯組成：全蝎5 g，蜈蚣1條，地龍10 g，陳皮15 g，半夏15 g，白術(shù)15 g，水蛭15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液備用。

1.3 給藥方法 根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體質(zhì)量折算系數(shù)9.0折算成小鼠用量：穩(wěn)斑湯低劑量組10 g/（kg·d）、中劑量組20 g/（kg·d）、高劑量組40 g/（kg·d），西藥組予他汀6 mg/（kg·d），模型組給予0.3 mL/d的生理鹽水。灌胃給藥每日1次，繼續(xù)喂養(yǎng)13周。另取正常小鼠12只予正常飼料喂養(yǎng)13周，設(shè)為空白對照組。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 取材前夜禁食，經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，-80℃凍存，用作測定血清過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）蛋白濃度。無菌條件下取出心臟及主動脈，心臟10%甲醛固定，主動脈放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。

1.4.1 主動脈組織病理學(xué)觀察 每組隨機(jī)取10只小鼠，麻醉處死，無菌條件下每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面，生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定。常規(guī)石蠟包埋，均勻間斷切片。HE染色，普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)；Masson染色，普通光鏡下觀察各斑塊中纖維成分的分布。

1.4.2 定時定量RT-PC檢測 先提取總RNA，然后取4 μL總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶及隨機(jī)引物等反應(yīng)物混合配成20 μL體系，42℃15 min，95℃，2 min反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，對小鼠PPAR-γ的表達(dá)進(jìn)行測定。引物序列：上游引物5′-AC CACTCGCATTCCTTTGAC-3′，下游引物5′-ATCGCA CTTTGGTATTCTTGGAG-3′。擴(kuò)增片段長度為154 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件學(xué)分析。計(jì)量資料以（s）表示。組間比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析，不同指標(biāo)間用直線相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腹主動脈病理切片比較 見圖1。空白對照組動脈內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞層呈現(xiàn)皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞。模型對照組：血管腔內(nèi)可見明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞、彈力纖維和膠原組織構(gòu)成，斑塊中央可見大量的脂質(zhì)聚集，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，偶見炎性細(xì)胞浸潤。出現(xiàn)斑塊的動脈內(nèi)膜區(qū)域嚴(yán)重破損。穩(wěn)斑湯低劑量組：血管腔內(nèi)可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞。偶見內(nèi)膜殘缺。穩(wěn)斑湯中、高劑量組及西藥組：動脈內(nèi)膜大部分較為光滑，偶見內(nèi)膜不全，內(nèi)膜不全區(qū)域可見明顯的脂質(zhì)條紋塊形成，偶見泡沫細(xì)胞聚集，有少量纖維成分交聯(lián)。

圖1 各組小鼠腹主動脈HE染色（100倍）

2.2 PPAR-γ mRNA表達(dá)水平比較 見圖2，表1。模型對照組PPAR-γ mRNA表達(dá)最低，穩(wěn)斑湯各劑量組及西藥組表達(dá)明顯高于空白組及模型對照組 （P< 0.01）。穩(wěn)斑湯各劑量組PPAR-γ mRNA表達(dá)比模型對照組明顯升高（P<0.01），與低劑量組相比，中高劑量組提高PPAR-γ mRNA表達(dá)更明顯。

圖2 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)電泳圖

表1 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)水平（s）

表1 各組小鼠腹主動脈組織中PPAR-γ mRNA表達(dá)水平（s）

與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.01。

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3 討 論

過氧化物酶體增殖激活物受體（PPARs）屬于核激素受體家族，是能被脂肪酸樣化合物過氧化物酶體增殖劑和脂肪酸激活的核轉(zhuǎn)錄因子，是一種配體激活的核受體。PPARs包括3個亞型，即α亞型、β亞型和γ亞型，其中PPARγ經(jīng)證實(shí)可以在血管、心臟、脂肪、肌肉、肝臟等多器官細(xì)胞中表達(dá)，是許多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵因子，有多種生物學(xué)效應(yīng)。PPARγ是PPARs中最具脂肪組織特異性的成員，參與糖、脂肪、能量代謝等過程，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞分化和胰島素敏感性［2］。PPARγ具有改善脂質(zhì)及調(diào)節(jié)泡沫細(xì)胞形成的作用，從而改善動脈粥樣硬化的病情［2］；PPARγ能夠抑制大鼠巨噬-泡沫細(xì)胞的形成，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生［4］；PPARγ同時還與冠狀動脈粥樣硬化的多個相關(guān)因素有關(guān)，包括炎癥、高血壓、高脂血癥、胰島素抵抗等［5］。因此PPARγ可能與冠狀動脈粥樣硬化的產(chǎn)生有關(guān)［6］。

冠心病屬中醫(yī)“胸痹”、“真心痛”的范疇。本病的發(fā)生多與寒邪內(nèi)侵、飲食失調(diào)、情志失節(jié)、勞倦內(nèi)傷、年邁體虛等因素有關(guān)。其病機(jī)有虛實(shí)之分，實(shí)為寒凝血瘀、氣滯痰濁，痹阻胸陽，阻滯心脈；虛為氣虛、陰傷、陽衰，肺脾肝腎虧虛，心脈失養(yǎng)。中醫(yī)認(rèn)為風(fēng)為百病之長，其性善行而數(shù)變，痰為百病之祟，這與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有相似之處，又有久病入絡(luò)，治宜搜風(fēng)通絡(luò)祛痰，從痰從風(fēng)論治。本實(shí)驗(yàn)穩(wěn)斑湯方中全蝎、蜈蚣具有息風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛之效。地龍具有清熱息風(fēng)、通絡(luò)利尿之效。陳皮、半夏、白術(shù)，三者既能燥濕化痰，又能理氣健脾消痞散結(jié)。水蛭為蟲類活血化瘀藥，破血逐瘀而不傷新血。諸藥合用共奏搜風(fēng)祛痰通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，全蝎能增加心肌收縮力，有抗血栓形成、擴(kuò)張血管、降低血壓的作用［7］；蜈蚣有抗心肌缺血［8］、加強(qiáng)心肌收縮力和擴(kuò)血管的作用；地龍具有解熱鎮(zhèn)靜、抗驚厥、平喘、抗血栓、降壓等作用［9］；陳皮能抑制血小板聚集，能降低血脂、預(yù)防動脈硬化及抗血液高凝狀態(tài)作用［10］；水蛭能增加腦血流量，改善腦缺氧狀況，降低血流黏稠度及降血脂，抑制體內(nèi)外血栓形成［11］。上藥合用，能夠更好地起到穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，搜風(fēng)祛痰法中藥能有效地提高細(xì)胞中PPAR-γ mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而有效地防止動脈粥樣硬化的發(fā)展，為治療提供理論基礎(chǔ)，但其全面深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

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Effect of Searching Wind and Removing Phlegm Method on Peroxisome Proliferator-activated Receptorγ Expression of ApoE-gene Knockout Mice

LI Ying1，GONG Lihong2. 1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China；2 Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China

Objective：To observe PPAR-γ expression level and to clarify the intervention mechanism of searching wind and removing phlegm method of traditional Chinese medicine on unstable atherosclerotic plaque of ApoE knockout mice.Methods：ApoE knockout mice with AS were randomly divided into 5 groups including model group，Wenban Decoction low dose group，Wenban Decoction middle dose group，Wenban Decoction high dose group，and the western medicine statin group.The pathological examinations such as HE staining and Masson staining method were used.Expressions of PPAR-γ mRNA were detected by RT-PCR.Results：Compared with the blank group and model group，PPAR-γ mRNA expression level in traditional Chinese medicine dose groups and western medicine group increased significantly（P<0.01）.Conclusion：Unstable plaque decoction can improve PPAR-γ mRNA expression level，and has the effect of stable plaques with different dose.

Searching wind and removing phlegm method；ApoE-gene knockout；Mice；Atheroscierosis；Unstable plaque；Peroxisome proliferator-activated receptor-γ

R285.5

A

1004-745X（2014）11-1968-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.003

2014-05-12）

中國博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20110491540）；遼寧省“百千萬人才工程”資助項(xiàng)目（2011921022）

△通信作者