亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        大鼠彌漫性腦損傷后腦源性及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子時序性表達的實驗研究

        2014-09-03 16:36:37陳梅花陳貴珍賈萬
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年19期
        關(guān)鍵詞:彌漫性腦損傷膠質(zhì)

        陳梅花++++++陳貴珍++++++賈萬鈞++++++孫汝亮++++++胡丙杰

        [摘要] 目的 探討膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在大鼠腦組織中的表達水平隨損傷時間的變化規(guī)律,以期為腦損傷時間的推斷提供新的實驗依據(jù)。 方法 將90只無特定病原體(SPF)SD大鼠隨機分為正常對照組(n=10)及實驗組(n=80),對實驗組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型,并根據(jù)傷后時間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組,每組各10只。采用免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠腦組織中GDNF和BDNF表達,比較各組大鼠腦組織不同部位及損傷時間GDNF、BDNF的表達和變化規(guī)律。 結(jié)果 大腦、小腦、腦干組織中GDNF和BDNF陽性信號灰度在損傷后1 h組表達升高,6 h組達最高峰,12 h組開始回落;1、3、6、12、24、48、72、120 h組大腦、小腦、腦干組織中GDNF陽性信號灰度值均顯著高于正常對照組(P < 0.05),各組各部位陽性信號面積密度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。 結(jié)論 BDNF、GDNF可以作為大鼠彌漫性腦損傷后經(jīng)過時間推斷的實驗指標。

        [關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;免疫組織化學(xué);圖像分析

        [中圖分類號] R651.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2014)07(a)-0017-04

        顱腦損傷時間的推斷是法醫(yī)病理工作者一直致力解決的問題。目前尚未找到可應(yīng)用于法醫(yī)檢案的切實可行的生物學(xué)指標。本實驗采用改良大鼠彌漫性腦損傷模型[1],應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析法探討膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line derived neuro trophic factor,GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在彌漫性腦損傷腦組織不同部位的表達水平隨損傷時間的變化規(guī)律及其相關(guān)性,以期為尋找腦損傷時間推斷提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        SPF級SD大鼠90只由中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[SYXK(粵)2007-2008],雄雌不限,體重:(250±10)g。隨機分為正常對照組(n=10)及實驗組(n=80),對實驗組大鼠建立改良的大鼠彌漫性腦損傷模型,并根據(jù)傷后時間分為1、3、6、12、24、48、72、120 h組,每組各10只。

        1.2 實驗試劑與儀器

        免疫組織化學(xué)試劑兔抗鼠GDNF一抗來自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司;兔抗鼠BDNF一抗來自武漢博士德公司;SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均來自福建麥新公司。病理圖像分析采用中山大學(xué)法醫(yī)系YC.TY-2050型法醫(yī)病理圖像分析系統(tǒng),定量測量(灰度域0~256,0為白,放大倍數(shù)200×)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 取材及處理 參照本研究組前期改良大鼠彌漫性腦損傷實驗?zāi)P徒1]的實驗方法,并用本研究前期自制的打擊裝置對實驗組大鼠造成腦損傷。實驗組按時間段分別用2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉斷頸取完整腦組織(圖1、2);正常對照組大鼠麻醉后斷頸取腦。所有取材均用10%甲醛固定72 h,在大腦正中外側(cè)1~2 mm處作矢狀切面,同一切面取大腦、小腦、腦干3個部位,取材厚度約5 mm,石蠟包埋,切片厚度約2 μm,分別進行常規(guī)HE染色。

        1.3.2 免疫組織化學(xué)實驗 常規(guī)脫臘至水,采用高壓修復(fù)抗原的方法,蒸餾水沖洗3 min×2次;3%H2O2室溫處理20 min;PBS緩沖液沖洗3 min×3次;血清封閉37℃水浴10 min;加入一抗(1∶200工作濃度),4℃冰箱過夜;4℃冰箱取出室溫放置10 min后,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;加入二抗,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;加入鏈酶菌抗生素蛋白-辣根過氧化物酶復(fù)合物,37℃水浴20 min,PBS緩沖液洗5 min×3次;DAB顯色,蘇木精復(fù)染,中性樹膠封片。以PBS替代一抗作為陰性對照。

        1.3.3 圖像分析 每張切片隨機取5個視野,分別測量GDNF、BDNF陽性反應(yīng)物面積密度、灰度值。

        1.4統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 HE染色結(jié)果分析

        腦組織損傷呈全腦局部彌漫性分布,有出血、神經(jīng)細胞腫脹、膠質(zhì)細胞嗜酸性變、腦組織疏松、神經(jīng)細胞變性壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象。在1、3 h 組出血改變較為明顯,其他改變沒有時間上的特異性分布。見圖3、4。

        2.2 GDNF、BDNF免疫組化染色

        GDNF、GDNF陽性結(jié)果為棕褐色,以PBS代替第一抗體作為陰性對照,未發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)內(nèi)有染為棕褐色顆粒。正常對照組可見大腦、腦干、小腦分子層細胞有散在GDNF、BDNF弱陽性反應(yīng),小腦浦肯野細胞有強陽性反應(yīng),陽性信號主要位于神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。實驗各組陽性信號表達部位與正常對照組相同,陽性信號的面積密度無明顯變化,陽性著色明顯加深(圖5,封三)。

        2.3 免疫組化染色結(jié)果分析

        表達強度經(jīng)圖像分析,測量陽性信號灰度值及面積密度值,做統(tǒng)計分析結(jié)果示:與正常對照組比較,1 h組GDNF信號灰度值開始增高(P < 0.05),3 h組表達增強到最高峰,12 h組有所回落,但仍高于正常對照組(P < 0.05),此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組。1、3、6、12、24、48、72、120 h組強度均顯著高于正常對照組水平(P < 0.05);各組陽性信號面積密度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。見表1。

        BDNF陽性信號灰度在損傷后1 h表達升高,6 h達最高峰,12 h開始回落,24 h回落到正常水平。各組陽性信號面積密度比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。見表2。

        3 討論

        GDNF對神經(jīng)元具有營養(yǎng)、保護和修復(fù)的作用[2-4],在本實驗中發(fā)現(xiàn)彌漫性腦損傷后GDNF表達水平上升,這種上升是機體對腦的保護性反應(yīng)[5],本實驗結(jié)果顯示腦損傷后GDNF表達水平升高迅速且靈敏,在1 h即具有顯著性;GDNF在腦損傷表達水平增高呈現(xiàn)與時間變化相關(guān)規(guī)律,損傷1 h GDNF陽性表達開始增高,3 h表達增強到最高峰,12 h有所回落,但仍高于正常對照組,此后一直持續(xù)在較高水平到120 h組,此外,大腦、小腦、腦干部位GDNF表達上調(diào)時間基本一致,符合腦損傷彌漫性分布的特點。

        理論上,由于GDNF在神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中都有表達[6-7],而腦損傷后兩種細胞的反應(yīng)程度和反應(yīng)時間不同[8],本研究期望在腦損傷后GDNF表達變化趨勢圖出現(xiàn)兩個高峰:神經(jīng)細胞引起的GDNF表達高峰和膠質(zhì)細胞引起的GDNF的表達高峰。本實驗只觀察到在3 h的表達高峰,可能是因為膠質(zhì)細胞反應(yīng)一直持續(xù)到120 h后,使得GDNF二次表達高峰延續(xù)到120 h后,在本實驗中由于受選取時間點限制,沒有反映這一規(guī)律;本實驗結(jié)果表達高峰出現(xiàn)在3 h,與王欣等[9]及陳寶友等[10]的研究結(jié)果不一致,這種不一致可能是損傷程度不同造成的。Wetmore等[11]的研究揭示神經(jīng)細胞有低水平BDNF mRNA表達,Sinson等[12]、Mocchetti等[13]及Wang等[14]分別在對缺血缺氧性腦損傷的研究中揭示BDNF對腦損傷具有保護作用。董吉容等[15]報道大鼠液壓腦損傷后BDNF mRNA表達呈一定的時序變化。BDNF在局部彌漫性腦損傷后表達變化規(guī)律目前沒有文獻報道,本研究對這一問題進行實驗研究。綜合前人的研究結(jié)果,本研究選擇BDNF作為研究指標具有下列理由:①選取指標具特異性,在正常腦組織中有表達在腦損傷后表達水平特異性改變;②對腦損傷的反應(yīng)具有敏感性,損傷后短時間內(nèi)表達水平即有改變;③腦損傷后表達水平變化呈一定的規(guī)律。本研究結(jié)果顯示,正常對照組大鼠BDNF弱陽性表達,實驗組BDNF蛋白表達水平呈明顯的時序性規(guī)律。由于本研究動物模型腦損傷彌漫性分布的特點,對彌漫性腦損傷后大鼠腦組織不同部位BDNF表達情況進行分析后發(fā)現(xiàn),大腦、小腦、腦干部位BDNF灰度值變化趨勢基本一致。本研究結(jié)果揭示BDNF在腦損傷后短期內(nèi)表達水平即有改變并且具有時序性規(guī)律,這種規(guī)律為將BDNF應(yīng)用到腦損傷時間推斷提供了實驗依據(jù)。

        本研究的BDNF表達高峰出現(xiàn)在傷后6 h,與賈叢林等[16]報道的在傷后2 h表達高峰,以及與董吉容等[15]報道的在輕度和中度損傷組分別在2、4 h表達高峰不一致,這種不一致可能是由于損傷機制和程度不同造成的。本研究建立的腦損傷病死率低,損傷不嚴重,因而引發(fā)的機體自我保護程度輕。這與董吉容等[15]報道的BDNF表達水平與損傷程度呈正相關(guān)一致。但是由于腦損傷方式不一,在不同損傷機制下腦損傷程度分級不一,所以本實驗的損傷程度與董吉容等[15]的損傷程度分級無可比性,因而表現(xiàn)在具體的表達水平變化趨勢上并不完全一致。與GDNF相比,BDNF表達水平在回到正常對照組水平前,各時間點上都有顯著性差異(P < 0.05),因此本研究認為BDNF作為腦損傷推斷時間的指標將會有更大的優(yōu)勢。

        [參考文獻]

        [1] 陳梅花,陳貴珍,賈萬鈞,等.改良大鼠彌漫性腦損傷實驗?zāi)P蚚J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(7):29-31.

        [2] Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al. GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons [J]. Science,1993,260(5111):1130-1132.

        [3] Nosrat CA,Tomac A,Lindgvist E,et al. Cellular expression of GDNF mRNA suggests multiple unctionsin-side and outside the nervous system [J]. Cell & Tissue Res,1996,286(2):191.

        [4] Batchelor PE,Liberatore GT,Wong JY,et al. Activating in the injured Striatum and brain -derived neurotrophic factor [J]. J Neurosci,1999,19(5):1708-1716.

        [5] Wei G,Wu G,Cao X,et al. Dynamic expression of glial cell Line- derived neurotrophic factor after cerebral ischemia [J]. Neuroreport,2000,11(6):1177-1183.

        [6] 周雪,章為,鄒小菊,等.膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達[J].華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1998, 29(3):289-291.

        [7] Springer JE,Mu X,Begmann LW. Expression of GDNF mRNA in rat and human nervous tissue [J]. Exp Neuroul,1994, 127(2):167.

        [8] 余望貽,李輝,楊錫平.三個遠交小鼠群體對戊巴比妥鈉和氨基甲酸乙酯的耐受性比較[J].上海實驗動物學(xué),1997, 17(2):105-106.

        [9] 王欣,廖志鋼,劉敏,等.重度顱腦損傷后GDNF表達的實驗研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2003,19(1):1-3.

        [10] 陳寶友,侯志勇.膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后皮層中的表達[J].中國康復(fù)理論與實踐,2008,1(14):24-26.

        [11] Wetmore C,Emfors P,Persson H,et al. Localization of brain-derived neurotrophic factors mRNA to neurons in the brain by in situ hybridization [J]. Exp Neuro,1990,109:141-152.

        [12] Sinson G,Perri BR,Mcltosh TK,et al. Improvement of congnitive deficits and decreased cholingergic neuronal cell loss and apoptosic cell death following neurotrophin infusion after experimental traumatic brain injury [J]. J Neurosurg,1997,86(1):511-516.

        [13] Mocchetti I,Wrathal JR. Neurotrophic factors in central nerves system trauma [J]. J Neurotrauma,1995,12(1):853-870.

        [14] Wang Z,Yao W,Deng Q,et al. Protective effects of BDNF over expression bone marrow stromal cell transplantation in rat models of traumatic brain injury [J]. J Mol Neurosci,2013,49(2):409-416.

        [15] 董吉容,朱誠,江基堯,等.大鼠液壓腦損傷后BDNF mRNA原位雜交組織化學(xué)表達的變化[J].中華創(chuàng)傷雜志,1998,14(3):151-153.

        [16] 賈叢林,田壁野,遲風(fēng)令.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在創(chuàng)傷后鼠腦中的表達[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,22(7):726-727.

        (收稿日期:2014-03-04 本文編輯:任 念)

        猜你喜歡
        彌漫性腦損傷膠質(zhì)
        人類星形膠質(zhì)細胞和NG2膠質(zhì)細胞的特性
        羊水栓塞和彌漫性血管內(nèi)凝血是如何發(fā)生的
        腦損傷 與其逃避不如面對
        幸福(2019年21期)2019-08-20 05:39:10
        支氣管鏡技術(shù)在彌漫性肺疾病中的應(yīng)用進展
        視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的研究進展
        依達拉奉治療彌漫性軸索損傷療效觀察
        側(cè)腦室內(nèi)罕見膠質(zhì)肉瘤一例
        磁共振成像(2015年1期)2015-12-23 08:52:21
        認知行為療法治療創(chuàng)傷性腦損傷后抑郁
        Bc1-2與Bcl-6在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的表達及意義
        新生兒腦損傷的早期診治干預(yù)探析
        亚洲精品无码精品mv在线观看| 亚洲永久精品ww47永久入口| 国产爆乳无码一区二区在线| 91自国产精品中文字幕| 日韩精品一区二区三区av| 91国产精品自拍在线观看| 凹凸国产熟女精品视频app| 日本道精品一区二区三区| 日本韩国一区二区三区| 亚洲精彩视频一区二区| 亚州无吗一区二区三区| 在线播放五十路熟妇| av潮喷大喷水系列无码| 乱人伦中文字幕在线不卡网站| 激情一区二区三区视频| 亚洲精品第四页中文字幕| 高潮毛片无遮挡高清视频播放| 国产成人精品电影在线观看| 亚洲国产成人精品91久久久| 亚洲高清在线视频网站| 日本a级一级淫片免费观看| 免费超爽大片黄| 蜜桃av噜噜一区二区三区| 国产盗摄XXXX视频XXXX| 婷婷久久亚洲中文字幕| 久久国产精品亚洲婷婷片| 中文字幕人妻少妇引诱隔壁| 亚洲av熟妇高潮30p| 在线观看中文字幕一区二区三区| 在线观看一区二区中文字幕| 日本a片大尺度高潮无码| 国产真实夫妇视频| 色综合久久精品中文字幕| 国产一区二三区中文字幕| 粉嫩av最新在线高清观看| 久久99国产精一区二区三区| 国精产品一区二区三区| 国产高清黄色在线观看91| 国产乱子伦一区二区三区国色天香 | 男女18禁啪啪无遮挡激烈网站| 激情综合一区二区三区|