姜爭 劉彥龍 王錫山

細(xì)胞周期對于維持細(xì)胞的正常生長發(fā)育分化是必須的，其各個水平都受到多種因子的嚴(yán)格調(diào)控以確保其正常進行，其中去泛素化酶也是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期的一個關(guān)鍵調(diào)控因子。細(xì)胞周期中許多重要的調(diào)控因子如細(xì)胞周期蛋白激酶CDKs和蛋白激酶抑制因子等均通過泛素化，進而由蛋白酶體降解。去泛素化酶可在蛋白酶體上將底物蛋白的泛素分子解離出來再循環(huán)，從而維持泛素水平與蛋白酶體功能穩(wěn)定，控制細(xì)胞周期調(diào)控因子的活性和功能，這一類去泛素化酶又被稱為管家去泛素化酶。有些去泛素化酶是通過調(diào)控泛素連接酶的穩(wěn)定性和活性來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。去泛素化酶還可以通過影響細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用。關(guān)于USP22如何調(diào)控細(xì)胞周期的機制并不明了。本文著重探討了USP22與可能靶點之間的聯(lián)系，以期初步確定USP22調(diào)控細(xì)胞周期的機制。

材料與方法

一、材料

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬三院2006至2007年間手術(shù)切除的82例結(jié)直腸癌患者的新鮮組織作為實驗對象，包括癌旁黏膜82例及其相配對的腺癌82例。同時收集研究病例的臨床病理資料，包括患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、浸潤深度及有無淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。

二、實驗方法

1.儀器與試劑：二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、熒光定量PCR儀、凝膠成像分析儀、水浴搖床、超純水儀。USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2、p14ARF、p16INK4a、GAPDH探針購自于美國Applied Biosystems公司。定量PCR相關(guān)試劑：RNA抽提試劑盒(上海生工)、TRIzol試劑(Invitrogen)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)、TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)。

2.USP22及其靶點的mRNA檢測：采用RT-PCR法，按試劑盒操作說明書分別提取總RNA 1 μg，RNA水平(μg/ml)=稀釋倍數(shù)×OD260值×40。RT-PCR反應(yīng)體系：0.1 μg/μl cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqMan?Universal PCR Master Mix 10 μl，加雙蒸水(ddH2O)至20 μl。擴增條件：先95℃預(yù)變性10 min；接著進行40個循環(huán)，包括95℃ 15 s和60℃ 1 min。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

用配對t檢驗 mRNA 表達(dá)差異；用One-Way ANOVA 分析各與臨床病理參數(shù)間的關(guān)聯(lián)性；用 Pearson coefficient 分析各基因間的關(guān)聯(lián)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、與癌旁組織相比，USP22 mRNA在癌組織中的表達(dá)顯著升高

經(jīng)t檢驗分析，USP22mRNA在癌癥組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.0001，圖1)。

二、USP22及其靶點在轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

去泛素化酶是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期的一個關(guān)鍵調(diào)控因子。這一調(diào)控過程是極為復(fù)雜的，涉及到細(xì)胞周期的多個水平。在這里，我們首先分析了USP22、BMI-1、c-Myc、p16INK4a、p14ARF和cyclin D2 在轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)聯(lián)性(表1)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，USP22 mRNA的表達(dá)與BMI-1 mRNA(r=0.790，P<0.0001),c-Myc mRNA(r=0.528，P<0.0001)、cyclin D2 mRNA(r=0.657，P<0.0001)，但是與p16INK4a mRNA(r=0.103，P=0.358)和p14ARF mRNA(r=0.039，P=0.731)無關(guān)。

三、mRNA聚類分析結(jié)果

為了確定上述基因的mRNA表達(dá)特點，我們采用k-均值聚類分析。分析結(jié)果顯示USP22、BMI-1、c-Myc和cyclin D2的表達(dá)呈聚集現(xiàn)象。按照四者的表達(dá)量可將其分為三組：高表達(dá)組16例、中表達(dá)組55例和低表達(dá)組11例。與臨床資料相對比，四者的表達(dá)與AJCC的分期進展顯著相關(guān)(P=0.005，圖2)。

表1 82例腸癌患者mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)聯(lián)性分析

注：c為腫瘤組；n為對照組

討 論

越來越多的實驗證實了BMI-1致癌基因相關(guān)的PcG途徑是調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞的主要機制[1-3]。到目前為止，很多實驗結(jié)果都顯示USP22和BMI-1在功能上存在很多交叉。因此，有學(xué)者提出USP22和BMI-1可能構(gòu)建一個共同體來調(diào)節(jié)腫瘤的進展[4]。此外，USP22為c-Myc功能所需，而BMI-1與c-Myc一起參與小鼠T、B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生。這些資料提示我們USP22、BMI-1、c-Myc三者間存在密切聯(lián)系。故我們首先探討了USP22、c-Myc和BMI-1之間的關(guān)聯(lián)性。在我們的實驗中，無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平，USP22、c-Myc和BMI-1之間均呈顯著正相關(guān)。

PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。關(guān)于PcG蛋白參與Akt通路調(diào)節(jié)的研究少有報道。Lee JY[5]等報道在乳腺癌組織中，MEL-18與AKT的活性呈負(fù)相關(guān)；MEL-18的表達(dá)減弱乳腺癌細(xì)胞的增長，導(dǎo)致G1期停滯，其可能的機制為通過不依賴INK4a/ARF的方式促使Akt通路失活進而下調(diào)cyclin D和p27 KIP1。為了確認(rèn)USP22是否能夠調(diào)控Akt通路，我們檢測并確認(rèn)了USP22、BMI-1、pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的關(guān)聯(lián)性。我們發(fā)現(xiàn)，USP22和BMI-1均與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)呈正相關(guān)，這提示我們USP22可直接或者通過BMI-1介導(dǎo)活化 Akt通路。因為PI3K可通過Akt、mTOR將有絲分裂信號傳遞給 p70 S6K1，使細(xì)胞周期主要蛋白如細(xì)胞周期素(cyclin D)的翻譯上調(diào)，促進G1期進展，使細(xì)胞周期加速，因此我們同時檢測并分析了cyclinD2與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，cyclin D2的表達(dá)與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。因此，USP22調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機制有可能是通過cyclin D2介導(dǎo)Akt通路的活性。

總之，USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平均呈顯著相關(guān)性，并且通過k-均值聚類分析示四者表達(dá)的高低與結(jié)直腸癌的臨床分期呈正相關(guān)，提示USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2四者間存在調(diào)控結(jié)直腸癌進展的機制。另外，上述四者的蛋白表達(dá)與p16INK4a和p14ARF的蛋白表達(dá)無相關(guān)性，但是均與Akt的活性呈正相關(guān)，提示USP22可能是通過不依賴INK4a/ARF的方式，而通過調(diào)節(jié)Akt的活性來控制細(xì)胞周期的進展。

[1] Park IK,Qian D,Kiel M,et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells.Nature,2003,423(6937):302-305.

[2] Lessard J,Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature.,2003,423(6937):255-260.

[3] Brabletz T,Jung A,Reu S,et al.Variable beta-catenin expression in colorectal cancers indicates tumor progression driven by the tumor environment.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10356-10361.

[4] Molofsky AV,Pardal R,Iwashita T,et al.Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.Nature,2003,425(6961):962-967.

[5] Zhang XY,Varthi M,Sykes SM,et al.The putative cancer stem cell marker USP22 is a subunit of the human SAGA complex required for activated transcription and cell-cycle progression.Mol Cell,2008,29(1):102-111.