李文鳳　房翠翠　霍英芝

摘要：為了解高海拔地區(qū)農(nóng)作物根際土壤自生固氮菌分布及優(yōu)勢菌株情況，以未施肥的油菜、玉米、青稞、小麥4種農(nóng)作物種植點為采樣地，對作物根際土壤自生固氮菌進行分離提純，并根據(jù)其固氮酶活性篩選固氮能力較強的菌株。結果表明：油菜根際自生固氮菌數(shù)量較多，其固氮能力較其他3種作物更高，其中固氮性最好的菌株為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）菌株。

關鍵詞：自生固氮菌；林芝；固氮酶活性；農(nóng)作物；根際

中圖分類號： S144.5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0385-02

收稿日期：2013-10-14

基金項目：西藏農(nóng)牧學院青年科研基金（編號：XZ-20130625）。

作者簡介：李文鳳（1982—），女，陜西吳起人，碩士，講師，主要從事土地資源與空間信息技術研究。Tel：（0894）5821066；E-mail：lwf1029@126.com。隨著生活水平不斷提高，人們對于飲食的衛(wèi)生、安全、保健性更加注重，使生產(chǎn)者更加注重農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整，因此產(chǎn)生了有利于環(huán)境保護和食品安全的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)即綠色農(nóng)業(yè)。在種植方面，應采取生物方法防治病蟲害，減少化肥、農(nóng)藥使用量，降低其殘留度，通過改善農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)境加快發(fā)展綠色食品、有機食品。目前，微生物肥料在農(nóng)業(yè)領域越來越受到關注[1-2]，我國正致力于推廣微生物肥料。固氮菌肥屬于微生物肥料，在自然界氮循環(huán)中起著重要作用，施用固氮菌肥可提高土壤有效氮素、增加農(nóng)作物產(chǎn)量[3-4]。 本研究以未施肥土壤的作物根際微生物為對象，分別對油菜、青稞、小麥、玉米的根際土壤自生固氮菌進行分離，測定其固氮酶活性，并篩選出具有高效固氮性的菌株，以期為固氮菌的有效利用提供參考。

1材料與方法

1.1土壤采集

供試土壤采自于西藏大學農(nóng)牧學院實習基地農(nóng)場。西藏大學農(nóng)牧學院位于西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)，海拔2 900 m，屬熱帶濕潤和半濕潤氣候，年降水量650 mm左右，年均溫度 8.7 ℃，土壤顯中性偏弱酸性（pH值6.5～7.0），有機質含量35%，全氮含量0.053%，速效磷含量9.9 mg/kg，速效鉀含量26.8 mg/kg。采集非豆科類作物青稞、小麥、玉米、油菜的根際土壤，裝入滅菌袋中，每個采樣袋須記錄采樣環(huán)境、時間、日期、類型。及時分離土樣，若不能及時分離應將土樣保存在4 ℃冰箱內(nèi)，并在2～3 d內(nèi)盡快完成所有土樣分離。

1.2培養(yǎng)基和主要儀器

自生固氮菌分離、培養(yǎng)分別采用固體、液體無氮培養(yǎng)基。無氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸鈣0.2 g、氯化鈉0.2 g、碳酸鈣5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.0，121 ℃滅菌備用。液體培養(yǎng)基即上述培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）。

主要儀器：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、氣相色譜儀、微量移液槍、冰箱、電子天平、顯微鏡、乙醇燈。

1.3自生固氮菌的分離和純化[5]

1.3.1根際土壤自生固氮菌分離稱取作物根際土壤10 g，放入滅菌后的三角瓶，加入95 mL滅菌水（0.85%生理鹽水或蒸餾水），200～250 r/min振蕩15 min，在無菌操作臺中靜置15 min，用移液槍吸取上層清液為試驗菌液。吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理鹽水中，振蕩搖勻即稀釋成10-1溶液；再從10-1溶液吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理鹽水中，振蕩搖勻即稀釋為10-2溶液，依次可稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6溶液。用無菌玻璃棒把經(jīng)過稀釋的菌液（10-3、10-4、10-5、10-6溶液）均勻涂在固體無氮培養(yǎng)基平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7～14 d。采用平板計數(shù)法統(tǒng)計土壤中自生固氮菌的數(shù)量。

1.3.2根際土壤自生固氮菌純化挑取少量菌液在固體無氮培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)后挑取單個菌落轉接在斜面固體無氮培養(yǎng)基上，待菌落長出保存于4 ℃冰箱備用。

1.4菌株鑒定

1.4.1菌落外觀特征通過劃線培養(yǎng)觀察單個菌落的外形特征。單個菌落為半透明圓形，乳白色，表面濕潤光滑，中間凸起呈黏稠狀。

1.4.2革蘭氏染色觀察選擇劃線培養(yǎng)的菌落，用草酸銨結晶紫染色1 min，水洗后加碘液覆蓋再染色1 min，再次水洗后加95%乙醇溶液，輕搖培養(yǎng)皿脫色20 s后再次水洗，最后用番紅染色2 min，沖洗后待干燥可進行鏡檢。

1.4.3莢膜染色選擇劃線培養(yǎng)的菌落用草酸銨結晶紫或石炭酸復紅染液進行初染5 min，水洗后待干燥再用墨汁襯染，干燥后進行鏡檢。

1.4.4淀粉水解選擇已培養(yǎng)的菌落，在培養(yǎng)皿上滴少量碘液，輕輕晃動培養(yǎng)皿使碘液均勻平鋪。若菌株周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解，呈陽性?？梢愿鶕?jù)透明圈大小判斷水解淀粉的能力。

1.4.5油脂水解將菌株接種在油脂培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d。若培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點，表明菌株能分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸，呈陽性反應。

1.4.6吲哚試驗將菌種接種于試管裝的蛋白胨水溶液培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)4 d以上，在培養(yǎng)基中加入1～2 mL乙醚，輕搖，靜置3 min，再沿試管壁緩慢滴入3～5滴乙醚（此時不可搖動），觀察反應，若乙醚層呈現(xiàn)紅色則為陽性反應。

1.4.7過氧化氫酶測定取少量菌液涂抹于已滴有5% H2O2的培養(yǎng)皿上，如立即產(chǎn)生氣泡則為陽性，反之為陰性。

1.4.8葡萄糖產(chǎn)酸將葡萄糖蛋白胨水溶液裝入試管 115 ℃ 滅菌30 min，把試驗菌株接種于滅菌后的培養(yǎng)液中，在28 ℃恒溫狀態(tài)下培養(yǎng)5 d，加入5滴40%KOH后，再加入等量5%α-萘酚，振蕩后于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min后觀察。若試管中物體呈紅色，則其反應為陽性。endprint

1.5固氮酶活性測定

固氮酶不但能將分子氮還原為氨，還可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C鍵化合物的還原，固氮酶可還原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用氣象色譜儀可快速測定固氮酶的乙炔還原活性。

將待測菌接種于50 mL三角瓶內(nèi)的無氮培養(yǎng)基中，用封口膜密封在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)1 d，再用無菌膠塞密封瓶口。用無菌注射器抽出5 mL氣體，再注入等量乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，抽取1 mL氣樣，在氣相色譜儀中測定乙炔還原活性，以1 h、1 mL培養(yǎng)物產(chǎn)生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔還原活性=實際乙烯峰值×標準乙烯濃度×試管容積24.9×標準乙烯峰值×樣品培養(yǎng)時間。

式中：24.9為常數(shù)，乙炔還原活性即產(chǎn)生的乙烯濃度[nmol/（h·mL）]。

2結果與分析

2.1不同作物根際自生固氮菌數(shù)量分布

自生固氮菌適宜生長的溫度為28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌會大量增殖。本研究采用平板計數(shù)法統(tǒng)計樣品自生固氮菌數(shù)量，結果見表1。適宜的稀釋度為10-4、10-5、10-6，本研究選取10-5 稀釋度進行計數(shù)。不同作物根際自生固氮菌數(shù)量不盡相同，油菜、玉米根際的自生固氮菌數(shù)量遠大于小麥、青稞。對菌種進行分離分別得到 19株自生固氮菌。

3結論

分離篩選了不同作物根際土壤自生固氮菌，對其形態(tài)特征和理化性質進行鑒定，并用乙炔還原法測定固氮能力。結果表明，在分離出的19株菌種中，油菜根際的自生固氮菌數(shù)量最多，且固氮酶活性較好，根據(jù)文獻[6]，結合菌株的形態(tài)學特征及部分生理生化反應特征，將從油菜根際分離的高效固氮菌株（油菜4）初步鑒定為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）。本研究根據(jù)乙炔還原法篩選出各樣地固氮效果最好的菌株，為下一步的跟蹤研究及開發(fā)利用提供基礎。

自生固氮菌在土壤耕層分布較多，作物根際的自生固氮菌可通過固氮酶作用為作物提供氮素營養(yǎng)，對提高作物產(chǎn)量具有一定作用，同時這類菌種還可產(chǎn)生大量植物激素，從而影響植物生理過程以促進植物生長。本研究篩選的具有高效固氮能力的菌株可繼續(xù)進行盆栽試驗，以期為作物肥效試驗奠定基礎，并為微生物菌體研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]陳今朝，向鄧云. 生物固氮的研究與應用[J]. 涪陵師專學報，2000，16（2）：93-96.

[2]葛誠. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陳文新，李阜棣，閆章才. 我國土壤微生物學和生物固氮研究的回顧與展望[J]. 世界科技研究與發(fā)展，2002，24（4）：6-12.

[4]李華，陳萬仁，王光龍. 生物固氮的研究與發(fā)展[J]. 鄭州工業(yè)大學學報，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，劉元，等. 幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2004，12（6）：690-697.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：353-370.endprint

1.5固氮酶活性測定

固氮酶不但能將分子氮還原為氨，還可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C鍵化合物的還原，固氮酶可還原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用氣象色譜儀可快速測定固氮酶的乙炔還原活性。

將待測菌接種于50 mL三角瓶內(nèi)的無氮培養(yǎng)基中，用封口膜密封在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)1 d，再用無菌膠塞密封瓶口。用無菌注射器抽出5 mL氣體，再注入等量乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，抽取1 mL氣樣，在氣相色譜儀中測定乙炔還原活性，以1 h、1 mL培養(yǎng)物產(chǎn)生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔還原活性=實際乙烯峰值×標準乙烯濃度×試管容積24.9×標準乙烯峰值×樣品培養(yǎng)時間。

式中：24.9為常數(shù)，乙炔還原活性即產(chǎn)生的乙烯濃度[nmol/（h·mL）]。

2結果與分析

2.1不同作物根際自生固氮菌數(shù)量分布

自生固氮菌適宜生長的溫度為28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌會大量增殖。本研究采用平板計數(shù)法統(tǒng)計樣品自生固氮菌數(shù)量，結果見表1。適宜的稀釋度為10-4、10-5、10-6，本研究選取10-5 稀釋度進行計數(shù)。不同作物根際自生固氮菌數(shù)量不盡相同，油菜、玉米根際的自生固氮菌數(shù)量遠大于小麥、青稞。對菌種進行分離分別得到 19株自生固氮菌。

3結論

分離篩選了不同作物根際土壤自生固氮菌，對其形態(tài)特征和理化性質進行鑒定，并用乙炔還原法測定固氮能力。結果表明，在分離出的19株菌種中，油菜根際的自生固氮菌數(shù)量最多，且固氮酶活性較好，根據(jù)文獻[6]，結合菌株的形態(tài)學特征及部分生理生化反應特征，將從油菜根際分離的高效固氮菌株（油菜4）初步鑒定為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）。本研究根據(jù)乙炔還原法篩選出各樣地固氮效果最好的菌株，為下一步的跟蹤研究及開發(fā)利用提供基礎。

自生固氮菌在土壤耕層分布較多，作物根際的自生固氮菌可通過固氮酶作用為作物提供氮素營養(yǎng)，對提高作物產(chǎn)量具有一定作用，同時這類菌種還可產(chǎn)生大量植物激素，從而影響植物生理過程以促進植物生長。本研究篩選的具有高效固氮能力的菌株可繼續(xù)進行盆栽試驗，以期為作物肥效試驗奠定基礎，并為微生物菌體研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]陳今朝，向鄧云. 生物固氮的研究與應用[J]. 涪陵師專學報，2000，16（2）：93-96.

[2]葛誠. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陳文新，李阜棣，閆章才. 我國土壤微生物學和生物固氮研究的回顧與展望[J]. 世界科技研究與發(fā)展，2002，24（4）：6-12.

[4]李華，陳萬仁，王光龍. 生物固氮的研究與發(fā)展[J]. 鄭州工業(yè)大學學報，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，劉元，等. 幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2004，12（6）：690-697.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：353-370.endprint

1.5固氮酶活性測定

固氮酶不但能將分子氮還原為氨，還可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C鍵化合物的還原，固氮酶可還原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用氣象色譜儀可快速測定固氮酶的乙炔還原活性。

將待測菌接種于50 mL三角瓶內(nèi)的無氮培養(yǎng)基中，用封口膜密封在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)1 d，再用無菌膠塞密封瓶口。用無菌注射器抽出5 mL氣體，再注入等量乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，抽取1 mL氣樣，在氣相色譜儀中測定乙炔還原活性，以1 h、1 mL培養(yǎng)物產(chǎn)生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔還原活性=實際乙烯峰值×標準乙烯濃度×試管容積24.9×標準乙烯峰值×樣品培養(yǎng)時間。

式中：24.9為常數(shù)，乙炔還原活性即產(chǎn)生的乙烯濃度[nmol/（h·mL）]。

2結果與分析

2.1不同作物根際自生固氮菌數(shù)量分布

自生固氮菌適宜生長的溫度為28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌會大量增殖。本研究采用平板計數(shù)法統(tǒng)計樣品自生固氮菌數(shù)量，結果見表1。適宜的稀釋度為10-4、10-5、10-6，本研究選取10-5 稀釋度進行計數(shù)。不同作物根際自生固氮菌數(shù)量不盡相同，油菜、玉米根際的自生固氮菌數(shù)量遠大于小麥、青稞。對菌種進行分離分別得到 19株自生固氮菌。

3結論

分離篩選了不同作物根際土壤自生固氮菌，對其形態(tài)特征和理化性質進行鑒定，并用乙炔還原法測定固氮能力。結果表明，在分離出的19株菌種中，油菜根際的自生固氮菌數(shù)量最多，且固氮酶活性較好，根據(jù)文獻[6]，結合菌株的形態(tài)學特征及部分生理生化反應特征，將從油菜根際分離的高效固氮菌株（油菜4）初步鑒定為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）。本研究根據(jù)乙炔還原法篩選出各樣地固氮效果最好的菌株，為下一步的跟蹤研究及開發(fā)利用提供基礎。

自生固氮菌在土壤耕層分布較多，作物根際的自生固氮菌可通過固氮酶作用為作物提供氮素營養(yǎng)，對提高作物產(chǎn)量具有一定作用，同時這類菌種還可產(chǎn)生大量植物激素，從而影響植物生理過程以促進植物生長。本研究篩選的具有高效固氮能力的菌株可繼續(xù)進行盆栽試驗，以期為作物肥效試驗奠定基礎，并為微生物菌體研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]陳今朝，向鄧云. 生物固氮的研究與應用[J]. 涪陵師專學報，2000，16（2）：93-96.

[2]葛誠. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陳文新，李阜棣，閆章才. 我國土壤微生物學和生物固氮研究的回顧與展望[J]. 世界科技研究與發(fā)展，2002，24（4）：6-12.

[4]李華，陳萬仁，王光龍. 生物固氮的研究與發(fā)展[J]. 鄭州工業(yè)大學學報，1997，18（3）：92-94.

[5]丁延芹，王建平，劉元，等. 幾株固氮芽孢桿菌的分離與鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報，2004，12（6）：690-697.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：353-370.endprint