付明　李勝華　張婷等

摘要：采用索氏提取法、乙醇浸提法、超聲波-乙醇法提取藤茶中二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），RP-HPLC法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，超聲波-乙醇法提取率最高，采用Sino chrome C18柱，以甲醇-0.1%磷酸（體積比27 ∶73）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm時(shí)，線性關(guān)系良好（r=0.999 2），平均加樣回收率為97.8%，RSD=0.69%；重現(xiàn)性試驗(yàn)RSD為0.33%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可信度高。湘西藤茶DMY含量在5月底達(dá)到最高，葉中約25.43%，莖中約6.22%，因此其最佳采摘時(shí)期為5月底。

關(guān)鍵詞：藤茶；最佳采摘期；超聲波-乙醇法；二氫楊梅素（DMY）；RP-HPLC

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.1；O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0332-03

收稿日期：2013-09-15

基金項(xiàng)目：湖南省科技計(jì)劃（編號(hào)：2013FJ6090）；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（編號(hào)：2010212）；湖南省“十二五”植物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目（編號(hào)：201142）。

作者簡(jiǎn)介：付明（1966—），女，湖北荊門(mén)人，副教授，主要從事植物生物化學(xué)研究。E-mail：fm6988@163.com。藤茶別稱顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），屬葡萄科蛇葡萄屬。湘西少數(shù)民族將其制成保健茶，長(zhǎng)年飲用可強(qiáng)身健體，還可治療感冒、咽喉腫痛、黃疸型肝炎等癥[1]。藤茶有抗氧化作用[2-3]，含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì)，其中主要是二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）。有研究表明，藤茶葉中總黃酮含量達(dá)45%[4-5]，DMY含量達(dá)16.32%～33.03%[6]，這是非常罕見(jiàn)的，吸引了許多學(xué)者開(kāi)展相關(guān)研究。黃酮物質(zhì)可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[7]、抑菌[8]、降血壓、降血糖[9-10]、減輕肝細(xì)胞變性和腫脹[11]、增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能和溶血功能、抗腫瘤、祛痰止咳等。隨著研究的深入，DMY降血糖、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等活性成為研究熱點(diǎn)。本研究以湘西藤茶為原料，從索氏提取法、乙醇浸提法、超聲波-乙醇法中選擇DMY提取率最高的方法提取樣品DMY，再用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對(duì)不同時(shí)期、不同部位DMY含量進(jìn)行測(cè)定，確定湘西藤茶的最佳采摘時(shí)期，為其合理開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

藤茶采自湖南省懷化市。DMY對(duì)照品（純度99%，湖南省張家界至誠(chéng)生物有限公司）；甲醇、磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），均為色譜純。

Waters 1525高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；JY98-IIDN 智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司）；FW177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1樣品溶液的制備將材料洗凈、切段、干燥后粉碎并過(guò)60目篩，密封保存。

索氏提取法：取樣品2.0 g置于索氏提取器中，回流提取8 h，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用65%乙醇定容至100 mL。取150 μL稀釋后用0.45 μm濾膜過(guò)濾制成相當(dāng)于原料 0.3 mg/mL 的樣品液1。

乙醇浸提法：取樣品2.0 g置于三角瓶中，加入65%乙醇，65 ℃下振蕩提取24 h，5 000 r/min離心，收集濾液，用65%乙醇定容至100 mL。同上處理得樣品液2。

超聲波-乙醇提取法：取樣品2.0 g加入40 mL 65%乙醇，于65 ℃溫水中浸提2 h；用超聲波處理20 min，離心；濾渣再用40 mL 65%乙醇超聲25 min，離心；合并濾液，用65%乙醇定容至100 mL。同上處理得樣品液3。

1.2.2色譜條件的選擇選擇色譜柱系Sino chrom C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積 20 μL；柱溫31 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水，分別用磷酸、磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH值，以不同的比例分別在294、310 nm波長(zhǎng)處進(jìn)樣，根據(jù)峰形確定最佳的色譜條件。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察取干燥后的DMY粉末0.010 6 g，用甲醇溶解、定容至10 mL，配成1.06 mg/mL的DMY對(duì)照品液。分別取DMY對(duì)照品溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6、1.9 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成不同濃度的對(duì)照品溶液。吸取各濃度對(duì)照品溶液20 μL，注入色譜儀，按確定的色譜條件測(cè)峰面積，以峰面積對(duì)DMY濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的確定

當(dāng)采用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，出現(xiàn)拖尾；加入磷酸二氫鈉時(shí)，拖尾現(xiàn)象稍有改善但分離效果不太好；加入磷酸時(shí)，消除了拖尾現(xiàn)象，峰形對(duì)稱，分離效果好。將甲醇-0.1%磷酸按（20～80） ∶（20～80）進(jìn)樣，當(dāng)甲醇、0.1%磷酸體積比27 ∶73時(shí)，對(duì)照品和樣品的各組分達(dá)到了良好的分離，且保留時(shí)間適中。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm時(shí)，DMY的峰無(wú)雜質(zhì)干擾。因此，確定最佳色譜條件為Sino chrom C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫31 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（27 ∶73），流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積 20 μL。按照該色譜條件將對(duì)照品和樣品液分別進(jìn)樣，RP-HPLC 圖譜分別見(jiàn)圖1、圖2，DMY保留時(shí)間約為 7.5 min。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的建立

以峰面積對(duì)對(duì)照品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=60 055.848 5x-73 641.974 2，r=0.999 2，說(shuō)明在4.24～8056 g/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。endprint

2.3二氫楊梅素提取方法的確定

將樣品液1、樣品液2、樣品液3分別在確定的色譜條件下進(jìn)樣，平均峰面積分別為2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，樣品液3的峰面積最大，說(shuō)明超聲波-乙醇法的提取效率最高，故采用超聲波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄DMY的峰面積（表1），計(jì)算RSD為1.6%。

2.6樣品中二氫楊梅素含量的測(cè)定

藤茶莖、葉中DMY含量在5月底達(dá)到最高，葉中含量約25.43%，莖中約6.22%，之后DMY含量逐漸降低。4—9月的藤茶莖、葉的DMY含量如圖3所示。

測(cè)定DMY含量的方法有分光光度法、比值-導(dǎo)數(shù)熒光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取顯齒蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm檢測(cè)，葉中DMY含量最高達(dá)31.25%，莖中最高達(dá)9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）為流動(dòng)相，用HPLC法測(cè)得閩產(chǎn)顯齒蛇葡萄葉中DMY含量為33.03%，莖中為4.49%[6]。結(jié)果的差異可能是由材料來(lái)源、提取方法、采用的柱、流動(dòng)相、柱溫等不同造成的，也說(shuō)明該植物在不同地區(qū)因地理、氣候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季節(jié)有很大區(qū)別。本試驗(yàn)選擇甲醇作流動(dòng)相，是因?yàn)榧状冀?jīng)濟(jì)實(shí)惠，并且毒性較乙腈??；重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD為0.33%，表明結(jié)果可信度高。

3結(jié)論

本研究比較了3種提取方法，結(jié)果表明超聲波-乙醇法提取樣品DMY的時(shí)間最短、提取率最高，該法可以作為提取黃酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省時(shí)、簡(jiǎn)便，方法靈敏、精密度高等特點(diǎn)，適合于藤茶DMY含量的測(cè)定。本研究測(cè)得湘西藤茶不同時(shí)期葉中DMY含量為11.21%～25.43%，莖中為30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健價(jià)值高。

參考文獻(xiàn)：

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[8]蕭力爭(zhēng)，郭維，劉素純，等. 茶葉提取物與二氫楊梅素抑菌活性比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35（2）：239-242.

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[11]鄭成，丘雅茹，招燕紅，等. 藤茶中二氫楊梅素的中試規(guī)模微波提取及降血糖作用研究[J]. 廣州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，6（6）：26-31.

[12]何桂霞，裴剛，楊偉麗，等. HPLC測(cè)定藤茶不同采收時(shí)期及不同部位的二氫楊酶素含量[J]. 中成藥，2004，26（3）：40-42.endprint

2.3二氫楊梅素提取方法的確定

將樣品液1、樣品液2、樣品液3分別在確定的色譜條件下進(jìn)樣，平均峰面積分別為2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，樣品液3的峰面積最大，說(shuō)明超聲波-乙醇法的提取效率最高，故采用超聲波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄DMY的峰面積（表1），計(jì)算RSD為1.6%。

2.6樣品中二氫楊梅素含量的測(cè)定

藤茶莖、葉中DMY含量在5月底達(dá)到最高，葉中含量約25.43%，莖中約6.22%，之后DMY含量逐漸降低。4—9月的藤茶莖、葉的DMY含量如圖3所示。

測(cè)定DMY含量的方法有分光光度法、比值-導(dǎo)數(shù)熒光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取顯齒蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm檢測(cè)，葉中DMY含量最高達(dá)31.25%，莖中最高達(dá)9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）為流動(dòng)相，用HPLC法測(cè)得閩產(chǎn)顯齒蛇葡萄葉中DMY含量為33.03%，莖中為4.49%[6]。結(jié)果的差異可能是由材料來(lái)源、提取方法、采用的柱、流動(dòng)相、柱溫等不同造成的，也說(shuō)明該植物在不同地區(qū)因地理、氣候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季節(jié)有很大區(qū)別。本試驗(yàn)選擇甲醇作流動(dòng)相，是因?yàn)榧状冀?jīng)濟(jì)實(shí)惠，并且毒性較乙腈??；重現(xiàn)性試驗(yàn)的RSD為0.33%，表明結(jié)果可信度高。

3結(jié)論

本研究比較了3種提取方法，結(jié)果表明超聲波-乙醇法提取樣品DMY的時(shí)間最短、提取率最高，該法可以作為提取黃酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省時(shí)、簡(jiǎn)便，方法靈敏、精密度高等特點(diǎn)，適合于藤茶DMY含量的測(cè)定。本研究測(cè)得湘西藤茶不同時(shí)期葉中DMY含量為11.21%～25.43%，莖中為30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健價(jià)值高。

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2.3二氫楊梅素提取方法的確定

將樣品液1、樣品液2、樣品液3分別在確定的色譜條件下進(jìn)樣，平均峰面積分別為2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，樣品液3的峰面積最大，說(shuō)明超聲波-乙醇法的提取效率最高，故采用超聲波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄DMY的峰面積（表1），計(jì)算RSD為1.6%。

2.6樣品中二氫楊梅素含量的測(cè)定

藤茶莖、葉中DMY含量在5月底達(dá)到最高，葉中含量約25.43%，莖中約6.22%，之后DMY含量逐漸降低。4—9月的藤茶莖、葉的DMY含量如圖3所示。

測(cè)定DMY含量的方法有分光光度法、比值-導(dǎo)數(shù)熒光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取顯齒蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm檢測(cè)，葉中DMY含量最高達(dá)31.25%，莖中最高達(dá)9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）為流動(dòng)相，用HPLC法測(cè)得閩產(chǎn)顯齒蛇葡萄葉中DMY含量為33.03%，莖中為4.49%[6]。結(jié)果的差異可能是由材料來(lái)源、提取方法、采用的柱、流動(dòng)相、柱溫等不同造成的，也說(shuō)明該植物在不同地區(qū)因地理、氣候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季節(jié)有很大區(qū)別。本試驗(yàn)選擇甲醇作流動(dòng)相，是因?yàn)榧状冀?jīng)濟(jì)實(shí)惠，并且毒性較乙腈?。恢噩F(xiàn)性試驗(yàn)的RSD為0.33%，表明結(jié)果可信度高。

3結(jié)論

本研究比較了3種提取方法，結(jié)果表明超聲波-乙醇法提取樣品DMY的時(shí)間最短、提取率最高，該法可以作為提取黃酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省時(shí)、簡(jiǎn)便，方法靈敏、精密度高等特點(diǎn)，適合于藤茶DMY含量的測(cè)定。本研究測(cè)得湘西藤茶不同時(shí)期葉中DMY含量為11.21%～25.43%，莖中為30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健價(jià)值高。

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