屈海泳　劉連妹　吳純

摘要：以小麥秸稈為唯一碳源，從發(fā)酵液中一代一代提取木霉菌，通過(guò)測(cè)定秸稈降解率，殘余秸稈有機(jī)質(zhì)含量，發(fā)酵液中氮、磷、鉀含量，研究木霉菌對(duì)秸稈的降解作用。結(jié)果表明：通過(guò)一代一代的從發(fā)酵液中提取木霉菌，其降解能力有所提高，提取到第4代時(shí)，降解能力最高，第4代后，木霉菌的降解能力下降。

關(guān)鍵詞：木霉菌；液體發(fā)酵；秸稈；纖維素降解

中圖分類號(hào)： S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0283-02

收稿日期：2013-07-17

基金項(xiàng)目：江蘇省黃河故道農(nóng)業(yè)資源開(kāi)發(fā)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：屈海泳（1972—），男，安徽宿州人，博士，副教授，從事園藝生理學(xué)研究。Tel：（0517）83591025；E-mail：quhaiyong@126.com。農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品。近年來(lái)，隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，傳統(tǒng)的秸稈利用方式逐漸被弱化和淘汰，大量剩余秸稈的處理成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中凸顯的問(wèn)題，一些農(nóng)民采取最簡(jiǎn)單的處理方式——焚燒或隨意堆棄，這樣既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了資源。據(jù)報(bào)道，我國(guó)年產(chǎn)各類農(nóng)作物秸稈達(dá)6.5億t，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1]。目前，有效利用率只占50%，其余部分大多被付之一炬，造成了大量的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)問(wèn)題，成為政府關(guān)心、社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。充分合理地利用秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的一個(gè)難題。近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一直在探索利用物理、化學(xué)和生物方法來(lái)降解農(nóng)作物秸稈，其中采用微生物來(lái)降解秸稈被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的方法，可克服機(jī)械粉碎法、熱處理法[2]、化學(xué)處理法的不足，成為秸稈降解領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。自然界中，許多細(xì)菌、放線菌和真菌能分解纖維素。秸稈中的纖維素含量占絕大部分，想要有效降解秸稈，先要有效分解其中的纖維素。真菌降解纖維素已得到廣泛認(rèn)可，已報(bào)道的對(duì)纖維素作用較強(qiáng)的菌株多是木霉屬、曲霉屬、青霉屬、枝頂孢霉屬、漆斑霉屬的。由于木霉屬真菌能分泌完整的纖維素酶系，可完全水解天然纖維素，所以有關(guān)專家更傾向研究木霉。姚強(qiáng)用液體搖瓶法從堿性土壤中篩選到降解纖維素的哈茨木霉[4]。木霉菌屬真菌門，廣泛存在于不同環(huán)境條件下的土壤中。木霉在生物防治上的抑菌防病特性及其在有機(jī)污染生物修復(fù)上的作用，使得木霉的研究引起重視。本試驗(yàn)通過(guò)木霉菌液體發(fā)酵促進(jìn)秸稈的降解，由于直接從田間分離或?qū)嶒?yàn)室保存的木霉菌存在著菌種退化現(xiàn)象，達(dá)不到理想降解秸稈的目的，所以筆者希望通過(guò)一代接著一代的發(fā)酵培養(yǎng)，提高木霉菌對(duì)秸稈的降解能力。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)菌種：木霉菌實(shí)驗(yàn)室篩選保藏，PDA培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基，pH值均自然，121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。

秸稈樣品：小麥秸稈來(lái)源于農(nóng)戶，風(fēng)干，剪成2～3 cm，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成過(guò)40目左右的秸稈粉，烘干至恒重。

1.2主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋、電子分析天平、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、微型植物粉碎機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、火焰光度計(jì)、擴(kuò)散皿、微量滴定管。

1.3方法

1.3.1菌種培養(yǎng)取置于實(shí)驗(yàn)室冰箱中的木霉菌，接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行種子活化，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3.2孢子液配制取培養(yǎng)5 d的木霉菌平板，加入5 mL無(wú)菌水將孢子刮下，取100 μL此懸液，加蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，在600 nm下測(cè)其吸光度，根據(jù)吸光度加入適量無(wú)菌水稀釋調(diào)節(jié)至同一水平，備用。

1.3.3秸稈發(fā)酵培養(yǎng)取5個(gè)250 mL錐形瓶，分別稱取2 g小麥秸稈粉末置于其中，再加入60 mL蒸餾水，混勻，經(jīng) 121 ℃ 高溫滅菌20 min，待其冷卻，調(diào)節(jié)pH值為6，然后用移液槍接種上述1 mL孢子液置于其中4個(gè)錐形瓶中，剩下一個(gè)作為空白不接種孢子液，置于30 ℃、 120 r/min的恒溫?fù)u床下發(fā)酵培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)束，用移液槍移取100 μL此發(fā)酵液，均勻涂于平板上，置于上述相同環(huán)境下培養(yǎng)，將第1次從發(fā)酵液中提取出培養(yǎng)的菌稱為1代菌；將錐形瓶充分搖勻，取適量發(fā)酵液，待測(cè)定其中養(yǎng)分含量。再次取5個(gè)上述相同容量錐形瓶，加入同樣質(zhì)量的新的秸稈和蒸餾水，相同處理，將1代菌種接入其中發(fā)酵培養(yǎng)，如此一直繼代培養(yǎng)，依次將得到2、3、4、5、6代菌，以冰箱中取出的木霉菌作為對(duì)照。

1.3.4測(cè)定項(xiàng)目與方法發(fā)酵結(jié)束后殘余秸稈有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定采用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法；發(fā)酵液中氮含量（以銨態(tài)氮含量計(jì)，下同）的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法；發(fā)酵液中磷含量的測(cè)定采用鉬酸銨-分光光度法；發(fā)酵液中鉀含量的測(cè)定采用火焰光度計(jì)測(cè)定法；秸稈降解率的測(cè)定：將降解過(guò)的秸稈粉過(guò)濾沖洗，除去菌體，105 ℃烘干至恒重，以不接菌的為對(duì)照，失重法計(jì)算秸稈降解率。

1.3.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析用Excel 2003和SPSS軟件進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1秸稈發(fā)酵前后顏色變化

經(jīng)高溫滅菌后，于錐形瓶中接種1 mL孢子液，結(jié)果（圖1-A）發(fā)現(xiàn)，該錐形瓶中上層溶液具有一定透明度，且顏色呈紅棕色。發(fā)酵后7 d（圖1-b），靜置一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵樣品的上層溶液顏色變成土黃色，且溶液渾濁。與加入木霉菌溶液相比，對(duì)照（不加木霉菌）上層溶液仍具有一定透明度，渾濁度相對(duì)較低。

2.2各代木霉菌對(duì)秸稈降解率的影響

從表1可以看出，木霉菌液體發(fā)酵對(duì)秸稈的降解具有一定的顯著效果，只是各代菌種的降解效果不同。從發(fā)酵液中提取出的木霉菌降解效果顯著好于對(duì)照，當(dāng)提取到第3、第4代時(shí)，其降解率到達(dá)最大，為19.35%；再提取到第5、第6代時(shí)，其降解率略有下降，其中6代菌下降最明顯。

3結(jié)論與討論endprint

本試驗(yàn)采用木霉菌降解秸稈，秸稈在發(fā)酵7 d之后，量均有減少，說(shuō)明木霉菌能有效降解秸稈。其中，3、4代菌的降解率較高，比對(duì)照高6.99%，通過(guò)一代一代的從發(fā)酵液中提取木霉菌，提高了秸稈降解能力，但也不是次數(shù)越多越好，當(dāng)提取到第5代時(shí)，秸稈降解率略有下降，到第6代時(shí)下降更明顯。從本試驗(yàn)結(jié)果可知木霉菌提取一定次數(shù)后，其降解能力會(huì)下降，這與楊小麗的試驗(yàn)結(jié)果[6]類似，通過(guò)對(duì)菌種一直繼代培養(yǎng)，淘汰培養(yǎng)過(guò)程中降解能力下降的菌株，選擇降解能力強(qiáng)的菌株。盧松通過(guò)研究微生物對(duì)玉米秸稈的腐解，得出秸稈的發(fā)酵過(guò)程是有機(jī)質(zhì)不斷分解的過(guò)程的結(jié)論[7]，與本研究結(jié)果一致，即有機(jī)質(zhì)含量變化與秸稈降解率變化基本一致。

通過(guò)具體分析各代菌發(fā)酵液中氮、磷、鉀含量的變化趨勢(shì)可以得出，整體養(yǎng)分含量通過(guò)對(duì)木霉菌的多次提取有所提高，提高的趨勢(shì)雖不同，但是當(dāng)提取到第4代時(shí)各養(yǎng)分含量都達(dá)到最大值，分別為89.95、49.29、134.26 mg/L。與對(duì)照相比，養(yǎng)分含量分別提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是當(dāng)繼續(xù)提取下去時(shí)，各養(yǎng)分含量均略有下降，與秸稈降解率的變化趨勢(shì)相同。本研究結(jié)合各養(yǎng)分含量與秸稈降解率的變化趨勢(shì)得出，4代菌的降解率最高，且其各養(yǎng)分含量均達(dá)到最高。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹玉鳳，李英，劉榮昌，等. 生物技術(shù)在處理農(nóng)作物秸稈飼料中的應(yīng)用[J]. 飼料研究，1999，22（1）：27-28.

[2]楊雪霞，陳洪章，李佐虎. 玉米秸稈氨化汽爆處理及其固態(tài)發(fā)酵[J]. 過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2001，1（1）：86-89.

[3]王淑軍，揚(yáng)從發(fā)，陳靜. 用于降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2001（12）：21-23.

[4]姚強(qiáng)，黃琰，陳冠軍. 哈茨木霉SDU3.87耐堿性纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2005，40（3）：110-115.

[5]史央，戴傳超，吳耀春，等. 植物內(nèi)生真菌強(qiáng)化還田秸稈降解的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（1）：144-149.

[6]楊小麗. 秸稈降解菌的選育及復(fù)配研究[D]. 鄭州：鄭州大學(xué)，2009.

[7]盧松. 微生物處理玉米秸稈的腐解特征研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.endprint

本試驗(yàn)采用木霉菌降解秸稈，秸稈在發(fā)酵7 d之后，量均有減少，說(shuō)明木霉菌能有效降解秸稈。其中，3、4代菌的降解率較高，比對(duì)照高6.99%，通過(guò)一代一代的從發(fā)酵液中提取木霉菌，提高了秸稈降解能力，但也不是次數(shù)越多越好，當(dāng)提取到第5代時(shí)，秸稈降解率略有下降，到第6代時(shí)下降更明顯。從本試驗(yàn)結(jié)果可知木霉菌提取一定次數(shù)后，其降解能力會(huì)下降，這與楊小麗的試驗(yàn)結(jié)果[6]類似，通過(guò)對(duì)菌種一直繼代培養(yǎng)，淘汰培養(yǎng)過(guò)程中降解能力下降的菌株，選擇降解能力強(qiáng)的菌株。盧松通過(guò)研究微生物對(duì)玉米秸稈的腐解，得出秸稈的發(fā)酵過(guò)程是有機(jī)質(zhì)不斷分解的過(guò)程的結(jié)論[7]，與本研究結(jié)果一致，即有機(jī)質(zhì)含量變化與秸稈降解率變化基本一致。

通過(guò)具體分析各代菌發(fā)酵液中氮、磷、鉀含量的變化趨勢(shì)可以得出，整體養(yǎng)分含量通過(guò)對(duì)木霉菌的多次提取有所提高，提高的趨勢(shì)雖不同，但是當(dāng)提取到第4代時(shí)各養(yǎng)分含量都達(dá)到最大值，分別為89.95、49.29、134.26 mg/L。與對(duì)照相比，養(yǎng)分含量分別提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是當(dāng)繼續(xù)提取下去時(shí)，各養(yǎng)分含量均略有下降，與秸稈降解率的變化趨勢(shì)相同。本研究結(jié)合各養(yǎng)分含量與秸稈降解率的變化趨勢(shì)得出，4代菌的降解率最高，且其各養(yǎng)分含量均達(dá)到最高。

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[6]楊小麗. 秸稈降解菌的選育及復(fù)配研究[D]. 鄭州：鄭州大學(xué)，2009.

[7]盧松. 微生物處理玉米秸稈的腐解特征研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.endprint

本試驗(yàn)采用木霉菌降解秸稈，秸稈在發(fā)酵7 d之后，量均有減少，說(shuō)明木霉菌能有效降解秸稈。其中，3、4代菌的降解率較高，比對(duì)照高6.99%，通過(guò)一代一代的從發(fā)酵液中提取木霉菌，提高了秸稈降解能力，但也不是次數(shù)越多越好，當(dāng)提取到第5代時(shí)，秸稈降解率略有下降，到第6代時(shí)下降更明顯。從本試驗(yàn)結(jié)果可知木霉菌提取一定次數(shù)后，其降解能力會(huì)下降，這與楊小麗的試驗(yàn)結(jié)果[6]類似，通過(guò)對(duì)菌種一直繼代培養(yǎng)，淘汰培養(yǎng)過(guò)程中降解能力下降的菌株，選擇降解能力強(qiáng)的菌株。盧松通過(guò)研究微生物對(duì)玉米秸稈的腐解，得出秸稈的發(fā)酵過(guò)程是有機(jī)質(zhì)不斷分解的過(guò)程的結(jié)論[7]，與本研究結(jié)果一致，即有機(jī)質(zhì)含量變化與秸稈降解率變化基本一致。

通過(guò)具體分析各代菌發(fā)酵液中氮、磷、鉀含量的變化趨勢(shì)可以得出，整體養(yǎng)分含量通過(guò)對(duì)木霉菌的多次提取有所提高，提高的趨勢(shì)雖不同，但是當(dāng)提取到第4代時(shí)各養(yǎng)分含量都達(dá)到最大值，分別為89.95、49.29、134.26 mg/L。與對(duì)照相比，養(yǎng)分含量分別提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是當(dāng)繼續(xù)提取下去時(shí)，各養(yǎng)分含量均略有下降，與秸稈降解率的變化趨勢(shì)相同。本研究結(jié)合各養(yǎng)分含量與秸稈降解率的變化趨勢(shì)得出，4代菌的降解率最高，且其各養(yǎng)分含量均達(dá)到最高。

參考文獻(xiàn)：

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[2]楊雪霞，陳洪章，李佐虎. 玉米秸稈氨化汽爆處理及其固態(tài)發(fā)酵[J]. 過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2001，1（1）：86-89.

[3]王淑軍，揚(yáng)從發(fā)，陳靜. 用于降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2001（12）：21-23.

[4]姚強(qiáng)，黃琰，陳冠軍. 哈茨木霉SDU3.87耐堿性纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，2005，40（3）：110-115.

[5]史央，戴傳超，吳耀春，等. 植物內(nèi)生真菌強(qiáng)化還田秸稈降解的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（1）：144-149.

[6]楊小麗. 秸稈降解菌的選育及復(fù)配研究[D]. 鄭州：鄭州大學(xué)，2009.

[7]盧松. 微生物處理玉米秸稈的腐解特征研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.endprint