摘要：為了探索天府黑兔卵巢中不同發(fā)育階段卵泡的組織定量結(jié)構(gòu)，采用連續(xù)石蠟切片技術(shù)，對(duì)4只天府黑兔母兔的卵巢進(jìn)行組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并利用組織形態(tài)測(cè)量軟件測(cè)量不同發(fā)育階段卵泡的直徑、卵母細(xì)胞的直徑和透明帶厚度。結(jié)果表明：原始卵泡的直徑為（40.23±0.27） μm，其卵母細(xì)胞的直徑為（23.86±2.23） μm；初級(jí)卵泡的直徑為（56.26±6.72） μm，其卵母細(xì)胞直徑為（31.03±1.33） μm；次級(jí)卵泡的直徑為（18132±17.12） μm，其卵母細(xì)胞直徑為（81.35±3.14） μm；三級(jí)卵泡的直徑為（750.69±32.69） μm，其卵母細(xì)胞直徑為（106.21±4.34） μm。卵泡直徑（x）和卵母細(xì)胞直徑（y）在發(fā)育過程中的回歸關(guān)系是y=2.297x0.643（r2=0.88）。

關(guān)鍵詞：兔；卵泡發(fā)育；組織學(xué)；直徑

中圖分類號(hào)： S829.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0204-03

收稿日期：2014-02-24

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：11ZA146）。

作者簡(jiǎn)介：張誼（1976—），男，四川仁壽人，碩士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖工作。E-mail：zhangyis707@163.com。隨著現(xiàn)代繁殖技術(shù)的發(fā)展，一些先進(jìn)的繁殖技術(shù)，如人工授精技術(shù)[1]、同期發(fā)情技術(shù)[2]、兔卵母細(xì)胞體外受精[3-4]及其胚胎移植技術(shù)[5]等逐步應(yīng)用于兔的繁殖過程，使其能夠進(jìn)行快速改良以提高生產(chǎn)性能，極大推動(dòng)了養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展。為了進(jìn)一步發(fā)展兔的繁殖生物技術(shù)，有必要對(duì)兔卵巢中卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行組織學(xué)研究，探討兔卵泡發(fā)育和閉鎖規(guī)律，為最大限度地利用兔卵巢上卵泡的潛能奠定基礎(chǔ)。

目前，正常生理?xiàng)l件下兔卵巢組織學(xué)定量研究較少，虞斌等用組織學(xué)方法對(duì)兔卵巢組織移植后進(jìn)行了研究[6]；毛冠平等研究了孕馬血清促性腺激素（PMSG）對(duì)兔進(jìn)行超數(shù)排卵處理后的卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)[7]；張金友等在研究兔超數(shù)排卵效果時(shí)，也對(duì)各種不同劑量單位PMSG、人絨毛膜促性腺激素（hCG）處理的兔卵巢進(jìn)行了組織學(xué)研究[8]；常蘭等對(duì)高原兔的卵巢進(jìn)行了組織結(jié)構(gòu)觀察[9]。

天府黑兔是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)歷時(shí)十余年培育的中型肉兔新品種。該兔全身毛色烏黑發(fā)亮、頭短粗、眼黑色、耳直立、體軀寬深、后軀發(fā)達(dá)；成年體質(zhì)量4～5 kg，窩產(chǎn)仔數(shù)8～12只，生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)性強(qiáng)。自然生理狀態(tài)下，天府黑兔卵巢卵泡發(fā)育方面的組織學(xué)研究尚未見報(bào)道。本研究通過組織切片與組織定量分析技術(shù)對(duì)其卵巢中卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行組織學(xué)測(cè)量，并分析卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞形態(tài)之間的關(guān)系，這對(duì)天府黑兔卵巢組織定量的深入研究以及充分利用其卵巢上卵母細(xì)胞的相關(guān)繁殖生物技術(shù)的應(yīng)用具有理論和實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1材料

4～5月齡天府黑兔4只，取自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研兔場(chǎng)，采用單籠飼養(yǎng)、自由飲水、自然光照。

1.2卵巢收集

兔麻醉后頸動(dòng)脈放血處死，剖開腹腔取出卵巢，用0.9%生理鹽水沖洗后放入10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，將卵巢皮質(zhì)修剪成15 mm×15 mm×5 mm的薄塊后，再次在10%中性福爾馬林溶液中固定48～72 h。

1.3石蠟切片的制作

卵巢在10%中性福爾馬林溶液中固定后，用全自動(dòng)組織脫水機(jī)（Lecia，TP-8，German）在乙醇梯度溶液（70%、80%、90%、95%、99%、100%）中脫水，透蠟，石蠟包埋后用切片機(jī)（Lecia RM235，German）進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度6 μm[10]，然后經(jīng)展片、脫蠟后，進(jìn)行HE染色、脫水，二甲苯透明，樹脂（C7901，Sigma，USA）封片。

1.4卵泡的分類

根據(jù)Hafes[11]對(duì)卵泡分類標(biāo)準(zhǔn)，將卵泡依直徑大小、透明帶的形成、卵泡腔的出現(xiàn)分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡和成熟卵泡。成熟卵泡通常發(fā)生排卵，在卵巢組織切片中呈空泡狀。

1.5組織切片觀察與測(cè)定

切到卵母細(xì)胞核的切片稱為中緯切片。用顯微鏡（Nikon，90i，Japan）獲取圖像，用ACT-2U生物圖像分析軟件（Nikon Laboratory Imaging Inc.，Japan）測(cè)量中緯切片上的卵泡、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)量的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用SAS8.1e統(tǒng)計(jì)分析軟件采用Pearson分析卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度之間的相關(guān)性，建立卵泡直徑與卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度之間的回歸關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1卵巢的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

兔的卵巢組織結(jié)構(gòu)包括生殖上皮、白膜（Al）、皮質(zhì)（Co）和髓質(zhì)（Me）。卵巢表面被覆扁平或立方的生殖上皮細(xì)胞，生殖上皮下為致密的結(jié)締組織構(gòu)成的白膜（圖1-A）。皮質(zhì)部在卵巢的外周，染色較深，含有不同發(fā)育階段的卵泡、閉鎖卵泡、基質(zhì)和血管。皮質(zhì)中原始卵泡（PrF）、初級(jí)卵泡（PF）分布于皮質(zhì)淺層。原始卵泡分布于皮質(zhì)的外周，單個(gè)或三五成群聚集存在，數(shù)量較多。初級(jí)卵泡分布于皮質(zhì)的外圍，單個(gè)散在或2～3個(gè)集中分布，數(shù)量較多；次級(jí)卵泡（SF）多分布于皮質(zhì)深層，數(shù)量少；三級(jí)卵泡突出于皮質(zhì)表層，數(shù)量極少。髓質(zhì)位于皮質(zhì)深層，髓質(zhì)含較多的彈性纖維，其中有許多較大的血管、淋巴管及神經(jīng)（圖1-B）。

2.2卵泡形態(tài)特征

原始卵泡呈圓形或卵圓形，由1個(gè)大而圓的卵母細(xì)胞和外包的1層扁平卵泡細(xì)胞構(gòu)成，分布在卵母細(xì)胞周圍。卵母細(xì)胞呈球形，HE染色胞質(zhì)呈粉紅色，胞核大而圓，位于卵母細(xì)胞中央，核仁明顯（圖1-C）。初級(jí)卵泡的體積比原始卵泡大，卵泡細(xì)胞發(fā)育為柱狀或立方狀細(xì)胞，并增至多層；當(dāng)卵母細(xì)胞被2～3層立方卵母細(xì)胞包圍時(shí)，卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間出現(xiàn)薄層透明帶，HE染色呈淡紅色（圖1-D）；初級(jí)卵泡因卵泡細(xì)胞的層數(shù)變化較大以及卵母細(xì)胞的增長(zhǎng)，其直徑大小差異較大。次級(jí)卵泡卵母細(xì)胞增大，顆粒細(xì)胞層數(shù)增多，透明帶增厚，卵泡膜增厚且內(nèi)外層清晰；當(dāng)顆粒細(xì)胞增至4～5層時(shí)，顆粒細(xì)胞排列疏松，靠近卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞緊密地包圍著卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間形成完整的透明帶，同時(shí)顆粒細(xì)胞間出現(xiàn)大小不等的卵泡腔，卵泡腔里充滿卵泡液（圖1-E）。三級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞進(jìn)一步增大，隨著卵泡腔的融合增大和卵泡液的增多，卵泡的直徑急劇增大，卵母細(xì)胞位于卵泡的一側(cè)，與周圍緊密排列的顆粒細(xì)胞一起形成卵丘，靠近透明帶的顆粒細(xì)胞形成典型的放射冠結(jié)構(gòu)，卵泡膜分化為內(nèi)外2層（圖1-F）。試驗(yàn)中未觀察到完整結(jié)構(gòu)的成熟卵泡，只見排卵后的巨大卵泡腔，泡腔直徑在1 000 μm以上。endprint

2.3卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度

不同發(fā)育階段卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度見表1。卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑（原始卵泡28.97～55.26 μm，初級(jí)卵泡45.69～87.56 μm）、卵母細(xì)胞直徑（原始卵泡1523～37.16 μm，初級(jí)卵泡25.17～49.08 μm）、透明帶厚度（次級(jí)卵泡3.07～6.16 μm，三級(jí)卵泡5.29～9.13 μm）在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中都有明顯的重疊，這說明卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的連續(xù)過程。

3討論與結(jié)論

3.1兔卵泡發(fā)育的組織學(xué)特征

兔的原始卵泡是由1個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞和單層扁平的卵泡細(xì)胞組成，在原始卵泡和初級(jí)卵泡中沒有觀察看到2個(gè)或2個(gè)以上卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，這與豬等多胎家畜和大熊貓[12]、雙峰駝[13]、羊駝[14]有很大的差異，而與白唇鹿、東北梅花鹿[15]相似。在大熊貓、雙峰駝中能看到1個(gè)卵泡中有多個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，在對(duì)羊駝卵巢卵泡系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí)，觀察到1個(gè)卵泡中有4個(gè)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象。單卵泡多卵母細(xì)胞的現(xiàn)象可能存在種屬特異性。

3.2透明帶的形成

透明帶是由卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞共同分泌某些物質(zhì)形成的，其主要成分是黏多糖。兔的透明帶是在卵母細(xì)胞外包圍2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡中開始出現(xiàn)，出現(xiàn)時(shí)間較早，這與牦牛[16]、水牛[17]相似，與川金絲猴[18]、大熊貓[12]、小熊貓[19]、東北梅花鹿[15]等不同（表3）。兔透明帶出現(xiàn)的時(shí)期晚于川金絲猴、大熊貓、小熊貓，早于東北梅花鹿，因此，透明帶出現(xiàn)早晚有種屬特異性。

表3部分動(dòng)物透明帶形成時(shí)期

動(dòng)物透明帶形成時(shí)期兔卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡形成透明帶川金絲猴卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[18]大熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[12]小熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[19]東北梅花鹿卵母細(xì)胞外包有3～4層卵母細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[15]牦牛卵母細(xì)胞外包有2～3 層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[16]水牛卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[17]

3.3卵母細(xì)胞發(fā)育和卵泡生長(zhǎng)的關(guān)系

在卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑與卵母細(xì)胞直徑之間呈顯著相關(guān)，其研究結(jié)果與高立云等在牛卵泡發(fā)育中的研究結(jié)果類似[20]，表明在活體或收集的卵巢采卵過程中，可以通過卵泡直徑來獲得發(fā)育形態(tài)正常的卵母細(xì)胞。卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈冪指數(shù)關(guān)系，可用方程y=2.296 5x0.642 9（r2=0.884 0）表示，這個(gè)結(jié)果與Lintern-Moore等[21]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈直線關(guān)系（y=a+bx）和Kaur等[22]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)關(guān)系（lgy=a+blgx）不同，這說明卵泡生長(zhǎng)與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)的回歸關(guān)系有著種屬特異性。

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2.3卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度

不同發(fā)育階段卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度見表1。卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑（原始卵泡28.97～55.26 μm，初級(jí)卵泡45.69～87.56 μm）、卵母細(xì)胞直徑（原始卵泡1523～37.16 μm，初級(jí)卵泡25.17～49.08 μm）、透明帶厚度（次級(jí)卵泡3.07～6.16 μm，三級(jí)卵泡5.29～9.13 μm）在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中都有明顯的重疊，這說明卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的連續(xù)過程。

3討論與結(jié)論

3.1兔卵泡發(fā)育的組織學(xué)特征

兔的原始卵泡是由1個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞和單層扁平的卵泡細(xì)胞組成，在原始卵泡和初級(jí)卵泡中沒有觀察看到2個(gè)或2個(gè)以上卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，這與豬等多胎家畜和大熊貓[12]、雙峰駝[13]、羊駝[14]有很大的差異，而與白唇鹿、東北梅花鹿[15]相似。在大熊貓、雙峰駝中能看到1個(gè)卵泡中有多個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，在對(duì)羊駝卵巢卵泡系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí)，觀察到1個(gè)卵泡中有4個(gè)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象。單卵泡多卵母細(xì)胞的現(xiàn)象可能存在種屬特異性。

3.2透明帶的形成

透明帶是由卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞共同分泌某些物質(zhì)形成的，其主要成分是黏多糖。兔的透明帶是在卵母細(xì)胞外包圍2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡中開始出現(xiàn)，出現(xiàn)時(shí)間較早，這與牦牛[16]、水牛[17]相似，與川金絲猴[18]、大熊貓[12]、小熊貓[19]、東北梅花鹿[15]等不同（表3）。兔透明帶出現(xiàn)的時(shí)期晚于川金絲猴、大熊貓、小熊貓，早于東北梅花鹿，因此，透明帶出現(xiàn)早晚有種屬特異性。

表3部分動(dòng)物透明帶形成時(shí)期

動(dòng)物透明帶形成時(shí)期兔卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡形成透明帶川金絲猴卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[18]大熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[12]小熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[19]東北梅花鹿卵母細(xì)胞外包有3～4層卵母細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[15]牦牛卵母細(xì)胞外包有2～3 層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[16]水牛卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[17]

3.3卵母細(xì)胞發(fā)育和卵泡生長(zhǎng)的關(guān)系

在卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑與卵母細(xì)胞直徑之間呈顯著相關(guān)，其研究結(jié)果與高立云等在牛卵泡發(fā)育中的研究結(jié)果類似[20]，表明在活體或收集的卵巢采卵過程中，可以通過卵泡直徑來獲得發(fā)育形態(tài)正常的卵母細(xì)胞。卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈冪指數(shù)關(guān)系，可用方程y=2.296 5x0.642 9（r2=0.884 0）表示，這個(gè)結(jié)果與Lintern-Moore等[21]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈直線關(guān)系（y=a+bx）和Kaur等[22]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)關(guān)系（lgy=a+blgx）不同，這說明卵泡生長(zhǎng)與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)的回歸關(guān)系有著種屬特異性。

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2.3卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑和透明帶厚度

不同發(fā)育階段卵泡直徑、卵母細(xì)胞直徑、透明帶厚度見表1。卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑（原始卵泡28.97～55.26 μm，初級(jí)卵泡45.69～87.56 μm）、卵母細(xì)胞直徑（原始卵泡1523～37.16 μm，初級(jí)卵泡25.17～49.08 μm）、透明帶厚度（次級(jí)卵泡3.07～6.16 μm，三級(jí)卵泡5.29～9.13 μm）在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中都有明顯的重疊，這說明卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的連續(xù)過程。

3討論與結(jié)論

3.1兔卵泡發(fā)育的組織學(xué)特征

兔的原始卵泡是由1個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞和單層扁平的卵泡細(xì)胞組成，在原始卵泡和初級(jí)卵泡中沒有觀察看到2個(gè)或2個(gè)以上卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，這與豬等多胎家畜和大熊貓[12]、雙峰駝[13]、羊駝[14]有很大的差異，而與白唇鹿、東北梅花鹿[15]相似。在大熊貓、雙峰駝中能看到1個(gè)卵泡中有多個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象，在對(duì)羊駝卵巢卵泡系統(tǒng)進(jìn)行研究時(shí)，觀察到1個(gè)卵泡中有4個(gè)卵母細(xì)胞的現(xiàn)象。單卵泡多卵母細(xì)胞的現(xiàn)象可能存在種屬特異性。

3.2透明帶的形成

透明帶是由卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞共同分泌某些物質(zhì)形成的，其主要成分是黏多糖。兔的透明帶是在卵母細(xì)胞外包圍2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡中開始出現(xiàn)，出現(xiàn)時(shí)間較早，這與牦牛[16]、水牛[17]相似，與川金絲猴[18]、大熊貓[12]、小熊貓[19]、東北梅花鹿[15]等不同（表3）。兔透明帶出現(xiàn)的時(shí)期晚于川金絲猴、大熊貓、小熊貓，早于東北梅花鹿，因此，透明帶出現(xiàn)早晚有種屬特異性。

表3部分動(dòng)物透明帶形成時(shí)期

動(dòng)物透明帶形成時(shí)期兔卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞的初級(jí)卵泡形成透明帶川金絲猴卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[18]大熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[12]小熊貓卵母細(xì)胞外包有1層矮柱狀卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[19]東北梅花鹿卵母細(xì)胞外包有3～4層卵母細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[15]牦牛卵母細(xì)胞外包有2～3 層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[16]水牛卵母細(xì)胞外包有2～3層卵泡細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)透明帶[17]

3.3卵母細(xì)胞發(fā)育和卵泡生長(zhǎng)的關(guān)系

在卵泡發(fā)育過程中，卵泡直徑與卵母細(xì)胞直徑之間呈顯著相關(guān)，其研究結(jié)果與高立云等在牛卵泡發(fā)育中的研究結(jié)果類似[20]，表明在活體或收集的卵巢采卵過程中，可以通過卵泡直徑來獲得發(fā)育形態(tài)正常的卵母細(xì)胞。卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈冪指數(shù)關(guān)系，可用方程y=2.296 5x0.642 9（r2=0.884 0）表示，這個(gè)結(jié)果與Lintern-Moore等[21]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈直線關(guān)系（y=a+bx）和Kaur等[22]所得到的卵泡生長(zhǎng)（x）與卵母細(xì)胞（y）的生長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)關(guān)系（lgy=a+blgx）不同，這說明卵泡生長(zhǎng)與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)的回歸關(guān)系有著種屬特異性。

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