易曉莉　馬曉　劉先方等

摘要：從Bt毒素殺蟲機理、受體類型、昆蟲對Bt毒素抗性機理及遺傳特性等方面進行了綜述，總結(jié)了近年來關(guān)于昆蟲對Bt毒素抗性的研究進展情況，并對其研究前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：昆蟲；Bt毒素；受體；抗性；遺傳特性；研究進展

中圖分類號：S482.3+9 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）07-0149-02

收稿日期：2013-10-18

基金項目：國家“863”計劃（編號：2013AA102507）；江蘇省六大人才高峰項目（編號：NY-025）。

作者簡介：易曉莉（1989—），女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。E-mail：yixiaoli19892008@163.com。

通信作者：李木旺，博士，研究員。E-mail：muwang_li@hotmail.com。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種能產(chǎn)生伴孢晶體和芽孢的革蘭氏陽性細菌，具有多個株系。由它產(chǎn)生的伴胞晶體對鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲的幼蟲具有特異的殺滅活性，所以這種伴胞晶體通常被稱為Bt毒素或Bt毒蛋白，編碼該蛋白的基因則被稱為Bt基因[1]。但Bt毒素并不是對所有的生物都具有毒性，它僅對昆蟲、線蟲及其他特定的物種表現(xiàn)出特異的毒性，尤其對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲表現(xiàn)出極高的特異性[2]；且不同株系的Bt菌系產(chǎn)生的毒蛋白也具有不同的特異性[3]。

1Bt毒素殺蟲機理

根據(jù)孢子形成方式的不同，Bt所產(chǎn)生的殺蟲晶體內(nèi)含物是由多種殺蟲蛋白組成的，這些蛋白被稱為Cry毒素或Cyt毒素。根據(jù)它們的氨基酸序列和基因序列將這些毒素分為67類，即Cry1～Cry67，它們對特定范圍內(nèi)的昆蟲表現(xiàn)出高度特異的殺滅活性，所以作為可噴射殺蟲劑的Bt產(chǎn)物具有一定的局限性，將Cry毒素引用到轉(zhuǎn)基因植物中可為農(nóng)業(yè)上的害蟲防治提供一種更加高效特異的方法[4]。Bt所產(chǎn)生的蛋白主要包含2類殺蟲活性成分，即殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal protein，ICP）和營養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal protein，VIP）[5]，后者不形成蛋白晶體，且兩者在進化上無同源性。其中，ICP由于具有對目標昆蟲特異的殺滅活性且對人及其他動物無害等特點，因此目前已被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲的控制，約占總體殺蟲剎市場的2%。ICP的毒性并非來自本身，但當它被特定的昆蟲取食以后，在昆蟲中腸的堿性環(huán)境中逐步降解為有殺蟲作用的活性肽，該活性肽與目標昆蟲中腸刷狀緣細胞膜泡（brush border membrane vesicle，BBMV）上的特異性受體相結(jié)合，引起細胞膜上孔洞的形成，致使細胞滲透平衡被破壞而發(fā)生滲透裂解[6]。同時，離子濃度梯度的改變也嚴重影響了中腸細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而阻礙昆蟲對養(yǎng)分的吸收，最終導致昆蟲停止取食而死亡。

2Bt毒素受體種類及作用

某一種殺蟲劑可用于防治的各類害蟲及使用范圍稱為殺蟲譜。作為殺蟲劑的Bt毒素也有其特定殺蟲譜。毒素的殺蟲譜在很大程度上是由昆蟲中腸BBMV上的特異性受體決定的，毒素必須與受體結(jié)合才具備殺蟲活性，因此昆蟲體內(nèi)特異性受體的種類是決定毒素殺蟲特性的關(guān)鍵因子之一[7]。有研究證明，在目標昆蟲體內(nèi)主要有氨肽酶N（aminopeptidaseN，APN）、類鈣黏蛋白（cadherin-likeprotein）、堿性磷酸酯酶（GPI-anchoredalkaline phosphatase）以及某種糖脂類（glycolipids）物質(zhì)等4種Bt毒素受體[8]。其中，APN和類鈣黏蛋白是昆蟲體內(nèi)與Bt密切相關(guān)的受體，所以對其研究也較為深入。APN是一種常見的蛋白酶，在動植物中分布廣泛。APN上具有與Cry毒素特異結(jié)合的位點，目前已經(jīng)確認某些鱗翅目昆蟲中腸BBMV上的APN是Bt毒素的主要結(jié)合對象。Cry毒素與APN受體的特異性結(jié)合是決定Cry毒素殺蟲活性的關(guān)鍵因素之一[9]。在家蠶（Bombyx mori）體內(nèi)，BmAPN1上與Bt毒素結(jié)合的區(qū)域位于異亮氨酸（Ile）135 至脯氨酸（Pro）198之間，該序列包含63個氨基酸殘基[10]。雖然所有的鱗翅目昆蟲的中腸BBMV上都有豐富的APNs，但由APN所介導的Cry1A家族毒素的毒力大小在不同昆蟲之前存在差異。

類鈣黏蛋白是依賴鈣離子的跨膜糖蛋白家族中的一員，在細胞增殖、分化以及細胞間的連接等生物過程中發(fā)揮重要作用。在昆蟲中腸內(nèi)，類鈣黏蛋白與Cry毒素具有高度的親和力，兩者緊密結(jié)合會使中腸上皮細胞的結(jié)構(gòu)和功能瓦解，最終導致昆蟲死亡[11]。純化得到煙草天蛾中腸BBMV上Cry1Ab毒素的受體Bt-R1，已被證明為一種類鈣黏蛋白，能與Cry1Ab毒素高度特異性結(jié)合[12]。且Bt-R1與Cry1Aa及Cry1Ac的結(jié)合特征與Cry1Ab相似，說明Bt-R1可能對Cry1A毒素家族具有高度親和力。

3昆蟲對Bt毒素抗性形成機理

Bt殺蟲晶體蛋白制劑及 Bt轉(zhuǎn)基因作物已被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治，一方面減少了化學殺蟲劑的使用及其所產(chǎn)生的環(huán)境問題，另一方面也導致目標昆蟲對其產(chǎn)生越來越強的抗性。據(jù)調(diào)查，已有多種昆蟲群體在自然環(huán)境下對Bt蛋白制劑及Bt轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生了抗性；也可在實驗室和溫室中通過人工選擇獲得多種昆蟲的抗性蟲系[13]。這些抗性蟲系對Bt毒素的抗性具有水平高、遺傳穩(wěn)定性好等特點，有的能夠在Bt作物上完成整個生活史，說明抗性風險廣泛存在于自然環(huán)境與人工環(huán)境中。

根據(jù)Bt毒素的殺蟲機制，可推測昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性的機理主要有Bt原毒素的溶解性及其水解能力、毒素與昆蟲中腸細胞膜上受體結(jié)合情況的變化、細胞膜上孔洞的形成與疏通及中腸上皮細胞的自我修復功能等[14]。其中，毒素與昆蟲中腸細胞膜上受體結(jié)合情況的變化是目前普遍認可的昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性的最主要機理。受體結(jié)合情況的變化主要包括結(jié)合能力的變化和特異性位點數(shù)目的改變。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，煙芽夜蛾抗性蟲系YHD對Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac產(chǎn)生抗性主要是由于這3種毒素在細胞膜上共同的結(jié)合受體發(fā)生改變，且這種抗性表現(xiàn)為隱性遺傳方式。有研究表明，Cry1Ac對中腸上皮細胞的作用取決于細胞膜上是否具有APN，在成功構(gòu)建了煙芽夜蛾的cDNA文庫基礎(chǔ)上，從YHD煙芽夜蛾中克隆了含有APN與Bt毒素特異結(jié)合的蛋白，稱為Bt結(jié)合蛋白[15]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，煙芽夜蛾YHD2品系對Cry1Ac產(chǎn)生高水平抗性的主要原因是類鈣黏蛋白發(fā)生了突變，編碼區(qū)發(fā)生了反向轉(zhuǎn)座子插入，導致該蛋白完全失活，使Bt毒素不能結(jié)合到中腸膜上[16]。因此，類鈣黏蛋白改變也是昆蟲對Bt產(chǎn)生抗性的主要原因之一。類鈣黏蛋白和APN都是棉鈴蟲的Cry1Ac受體，它們的突變分別產(chǎn)生抗性蟲系GYBT和Bt-R。在Bt毒素殺滅害蟲過程中，類鈣黏蛋白為毒素的第一受體，APN為其第二受體，它們分別在不同的過程中發(fā)揮作用，這2類受體的改變必然導致昆蟲對Bt毒素產(chǎn)生一定的抗性。

4抗性形成的分子機制和遺傳特性研究

昆蟲對Bt毒素的抗性與晶體毒素的致毒機理密切相關(guān)，Bt毒素在殺蟲過程中的任何一個步驟發(fā)生改變，都可能會導致昆蟲產(chǎn)生抗性，因此體現(xiàn)出抗性機制的多樣性。不同抗性機制所引起的抗性表現(xiàn)出各種遺傳特性，如抗性水平的差異、不同的抗譜、顯隱性和交叉抗性等。因此，有必要對抗性機制和遺傳特性進行更加深入的研究。

Bt抗性的遺傳方式隨蟲種和殺蟲晶體蛋白類型不同而不同，但多為隱性遺傳，只受少數(shù)基因位點控制[17]。煙芽夜蛾YHD2蟲系是在室內(nèi)經(jīng)過人工篩選得到的，對CrylAc具有1萬倍以上的抗性，且表現(xiàn)為隱性遺傳。經(jīng)過回交連鎖分析，將該蟲系的抗性主效基因定位在第9連鎖群上2個分子標記之間，命名為BTR-4，是第1個被鑒定的Bt抗性基因?？寺“l(fā)現(xiàn)的BTR-4是一個已發(fā)生突變的鈣黏蛋白基因，在第5個鈣黏蛋白的編碼序列中插入了1個反轉(zhuǎn)座子，導致該鈣黏蛋白的編碼提前終止，失去了與Cry1Ac結(jié)合的能力，從而使煙芽夜蛾對Cry1Ac毒素產(chǎn)生高度抗性[18]。隨后，人們又從Bt轉(zhuǎn)基因棉中篩選獲得了7個Cry1Ac抗性蟲系，有研究表明它們的抗性都是由鈣黏蛋白基因的突變造成的[19]。

利用cDNA-AFLP方法分析了室內(nèi)篩選的棉鈴蟲抗、感2種品系基因間的差異，發(fā)現(xiàn)抗性蟲系體內(nèi)的APN缺失了可與CrylAc結(jié)合的片段，導致毒素不能與受體結(jié)合而使昆蟲對其產(chǎn)生抗性，說明棉鈴蟲抗性品系中APN基因的缺失突變與CrylAc的抗性相關(guān)[20]。最近鑒定出1個煙芽夜蛾抗性品系的抗性等位基因，該基因由1個編碼ATP結(jié)合盒（ABC，ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白分子的基因突變而來。這一基因的突變影響了Cry1A毒素與煙芽夜蛾中腸BBMV的結(jié)合，說明ABC轉(zhuǎn)運蛋白分子可能作為一個新的Cry1A毒素受體，與低聚物和細胞膜的結(jié)合有關(guān)[21]。

以家蠶為研究對象，通過圖位克隆鑒定出15號染色體上一個候選基因BGIBMGA007792-93，該基因以隱性方式控制家蠶對Cry1Ab的抗性。與上述煙芽夜蛾相似，該基因也編碼一個ABC轉(zhuǎn)運蛋白分子，且在家蠶中腸中表達[22]。

5昆蟲對Bt毒素抗性研究前景

由于多種昆蟲對毒素產(chǎn)生抗性的機理基本相似，在不同Bt毒素間容易產(chǎn)生交互抗性，且Bt品系和殺蟲毒素間的交互抗性型也會隨不同的抗性昆蟲而有所不同[23]。雖然已對抗性的發(fā)生鑒定出多種潛在機理，但昆蟲對Bt抗性的機理并無定論，分子生物學技術(shù)的發(fā)展有助于進一步研究不同昆蟲對不同Bt毒素產(chǎn)生抗性的機制，從而進一步篩選、利用最高效的Bt毒素，發(fā)展多樣化的Bt制劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物。

隨著對Bt毒素受體等研究的深入，逐漸明確昆蟲對Bt制劑或轉(zhuǎn)Bt植物產(chǎn)生抗性的機制，以更好地持續(xù)利用Bt毒素這一珍貴的生物殺蟲劑資源[24]。同時，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的Bt毒素受體，這些新的受體基因的功能及其產(chǎn)生的突變與Bt抗性的關(guān)系成為未來昆蟲對Bt毒素抗性機制研究的重點之一。這些研究為農(nóng)林害蟲的抗性監(jiān)測和提出預防性的抗性治理策略提供了科學依據(jù)，這對我國Bt毒素制劑及轉(zhuǎn)Bt植物的可持續(xù)應用具有重要意義。

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