宋興超，徐 超，王 雷，巴恒星，王桂武，楊福合

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130112)

鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因序列比較及分子進(jìn)化分析

宋興超，徐 超，王 雷，巴恒星，王桂武，楊福合*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130112)

以GenBank中已登錄的梅花鹿(Cervusnippon)、馬鹿(Cervuselaphus)、普通牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、山羊(Caprahircus)和綿羊(Ovisaries)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)基因mRNA序列為研究材料，通過(guò)DNAStar 7.0等生物信息學(xué)軟件對(duì)6個(gè)物種的IGF-1基因進(jìn)行序列比較及分子進(jìn)化分析。結(jié)果表明：鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因編碼區(qū)均為465 bp，并且堿基組成表現(xiàn)為G>C>A>T，且G+C含量高于A+T；6個(gè)物種IGF-1基因密碼子第1位富含A，密碼子第2位4種堿基的分布相對(duì)均勻，密碼子的第3位堿基C含量較高；編碼區(qū)堿基序列中共檢測(cè)到20個(gè)變異位點(diǎn)，包括10個(gè)單一變異和10個(gè)簡(jiǎn)約變異，鹿科和?？苿?dòng)物IGF-1基因核苷酸和氨基酸序列的相似性均較高；(4) NJ和UPGMA兩種方法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)均把6個(gè)物種聚為2個(gè)大類(lèi)：鹿科和?？?，其中牛科又分支出牛亞科和羊亞科兩類(lèi)。

鹿科；?？疲灰葝u素樣生長(zhǎng)因子-1基因；序列比較；密碼子

胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factors，IGFs)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)物體組織內(nèi)且能夠促進(jìn)細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)沉積、骨骼增長(zhǎng)以及個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子[1]。IGFs系統(tǒng)包括I型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、II型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1 R和IGF-2 R)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)、IGFBP相關(guān)蛋白及IGFBP酶等[2]。其中，IGF-1基因被認(rèn)為是影響動(dòng)物生長(zhǎng)性狀的重要候選基因，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在畜禽育種研究中的逐漸應(yīng)用，IGF-1基因也作為一種有效的遺傳標(biāo)記在豬[3]、牛[4]、羊[5]和雞[6]等畜禽上進(jìn)行了較為深入的研究，特別是近年來(lái)，有關(guān)鹿科動(dòng)物IGF-1基因分離、鑒定及其與鹿茸生長(zhǎng)關(guān)系的研究資料相對(duì)豐富。杜智恒等[7]首次在國(guó)內(nèi)對(duì)梅花鹿IGF-1基因進(jìn)行了克隆，獲得DNA核苷酸序列長(zhǎng)度為764 bp且與豬、牛和羊該基因同源性均為90%以上。胡薇等[8]通過(guò)RT-PCR方法分離得到梅花鹿IGF-1基因465 bp mRNA序列，相對(duì)熒光定量PCR差異分析發(fā)現(xiàn)該基因在鹿茸頂端的前軟骨和軟骨組織的表達(dá)水平高于真皮和間充質(zhì)組織。郝林琳等[9]采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)馬鹿該基因5′調(diào)控區(qū)含有CpG島和253個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)并且與牛、羊存在差異。李兆志等[10]利用PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)到左家地區(qū)梅花鹿群體IGF-1基因啟動(dòng)子區(qū)包括多個(gè)突變位點(diǎn)。到目前為止，IGF-1基因被認(rèn)為是刺激鹿茸細(xì)胞分裂增殖最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，并且NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)能夠檢索到多個(gè)鹿科動(dòng)物IGF-1基因序列，同時(shí)，?？婆c鹿科動(dòng)物同屬偶蹄目反芻動(dòng)物，而生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于這兩種動(dòng)物都是非常重要的經(jīng)濟(jì)性狀。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)鹿科和?？苿?dòng)物IGF-1基因mRNA序列進(jìn)行比較，進(jìn)一步構(gòu)建6個(gè)物種的分子進(jìn)化樹(shù)，旨在探討鹿科和牛科動(dòng)物該基因序列變異特點(diǎn)及物種進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步尋找IGF-1基因功能分化位點(diǎn)提供生物學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

從GenBank的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中下載梅花鹿、馬鹿、普通牛、水牛、山羊和綿羊的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)基因全長(zhǎng)cDNA序列，各物種序列信息見(jiàn)表1。

1.2 分析方法

鹿科和?？苿?dòng)物IGF-1基因核苷酸序列堿基組成由BioEdit 7.0和DNAStar 7.0軟件完成；采用DNAStar 7.0軟件中MegAlign程序?qū)?個(gè)物種IGF-1基因編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行差異分析及相似性比較；利用Clustal X 1.83對(duì)IGF-1基因氨基酸序列進(jìn)行完全比對(duì)，進(jìn)一步基于MEGA 5.05軟件的NJ(neighbor-joining，鄰近法)和UPGMA(unweighed pair group method with arithmetic mean,非對(duì)組算數(shù)平均法)2種方法分別進(jìn)行鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因分子進(jìn)化分析。

表1 從NCBI中獲取的鹿科和?？苿?dòng)物 IGF-1基因核苷酸和氨基酸序列Table 1 Nucleotide and amino acid sequences of IGF-1 gene of Cervidae and Bovidae species

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA序列堿基組成

由表2可知，鹿科與?？苿?dòng)物該基因編碼序列堿基組成基本一致，均為G>C>A>T，且G+C含量高于A+T，梅花鹿和馬鹿的T堿基百分含量最低。從4種堿基在密碼子的分布情況可知，鹿科和?？苿?dòng)物密碼子中堿基分布存在相似的規(guī)律，密碼子第1位富含A，密碼子第2位4種堿基的分布相對(duì)均勻，密碼子的第3位C堿基含量較高，A堿基含量最低，其中梅花鹿C堿基含量達(dá)39.4%，而水牛的A堿基含量最低，為11.0%。

表2 鹿科和?？苿?dòng)物IGF-1基因cDNA序列堿基組成Table 2 Base composition of IGF-1 gene of Cervidae and Bovidae species

注：表中數(shù)字1，2，3分別代表密碼子的第1、2、3位。

Note：No.1,2 and 3 represent the 1st,2ndand 3rdcodon position,respectively.

2.2 核苷酸與氨基酸序列變異

GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的鹿科和?？苿?dòng)物IGF-1基因mRNA序列長(zhǎng)度不一致，其中鹿科中的梅花鹿和馬鹿分別為465 bp和809 bp，?？苿?dòng)物中普通牛、水牛、山羊和綿羊分別為874 bp、538 bp、978 bp和595 bp，但鹿科與?？苿?dòng)物該基因完整編碼區(qū)序列均為465 bp，這6個(gè)物種編碼序列堿基變異情況如圖1所示，以梅花鹿IGF-1基因序列作為標(biāo)準(zhǔn)，共檢測(cè)到20個(gè)變異位點(diǎn)，其中，10個(gè)單一變異位點(diǎn)(Singleton variable sites)為：g.84A>G，g.111C>T，g.131C>G，g.201C>T，g.240C>T，g.258G>A，g.343C>G，g.354G>A，g.435C>G，g.439G>T，10個(gè)簡(jiǎn)約變異位點(diǎn)(Parsimony informative sites)為：g.78C>A，g.79G>A，g.105C>T，g.153 C>T，g.270 G>A，g.276A>C，g.330C>T，g.346A>G，g.352G>T，g.429C>T。在梅花鹿與馬鹿及普通牛與水牛IGF-1基因序列中，僅存在3個(gè)變異位點(diǎn)，而山羊與綿羊間卻產(chǎn)生了8個(gè)堿基變異。另外，在變異的堿基中，發(fā)生在第3密碼子位置上有14處，占70%，密碼子第1位存在5處堿基變異，只有1處變異發(fā)生在密碼子第2位，表現(xiàn)出密碼子的第2位非常保守，密碼子堿基第3位的變異率明顯高第1、2位，符合密碼子擺動(dòng)性的特點(diǎn)。序列相似性比對(duì)表明梅花鹿與馬鹿、普通牛、水牛、山羊和綿羊IGF-1基因編碼區(qū)核苷酸序列相似性分別為99.4%、98.1%、97.6%、97.6%和97.6%。

圖1 鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因編碼區(qū)堿基變異位點(diǎn)(·表示相同核苷酸)Fig.1 Nucleotide variable sites of IGF-1 gene between Cervidae and Bovidae species(·Indicates the identity of nucleotides)

從氨基酸序列比對(duì)結(jié)果來(lái)看(圖2)，鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因均編碼154個(gè)氨基酸，鹿科動(dòng)物中梅花鹿與馬鹿IGF-1基因編碼氨基酸序列相似性為99.4%，牛科動(dòng)物中普通牛與水牛、山羊和綿羊的相似性分別為100%、98.7%和98.1%，普通牛和水牛的氨基酸序列完全一致。

圖2 鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因編碼區(qū)氨基酸變異位點(diǎn)(·表示相同氨基酸)Fig.2 Amino acid variable sites of IGF-1 gene in Cervidae and Bovidae species (·indicates the identity of amino acid)

2.3 分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

鹿科和牛科動(dòng)物的IGF-1基因編碼區(qū)核苷酸序列通過(guò)MEGA 5.0軟件的NJ法和UPGMA法分別構(gòu)建6個(gè)物種分子進(jìn)化樹(shù)(圖3和4)，Bootstrap值是基于1000次模擬產(chǎn)生的，各個(gè)分支的置信度較高，結(jié)果表明，兩種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)均把6個(gè)物種聚為2個(gè)大類(lèi)：鹿科和?？?，其中?？朴址种С雠喛坪脱騺喛苾深?lèi)，這種聚類(lèi)與NCBI中動(dòng)物系統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果基本相符。

3 討 論

3.1 鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因序列差異

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了鹿科與?？苿?dòng)物IGF-1基因的堿基組成特點(diǎn)，同時(shí)參考了前人的研究結(jié)果，最終發(fā)現(xiàn)，該研究中所涉及到的6種動(dòng)物的A、T、C、G的含量與胡薇等[8]研究結(jié)果基本一致，均為G+C含量明顯高于A+T。王寧等[11]研究表明，G+C含量與核苷酸替代速率之間呈反比，由于IGF-1基因在哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中起主要調(diào)控作用，該基因的表達(dá)量決定了物種的生長(zhǎng)速度，其編碼區(qū)核苷酸替代速率必然低于非功能基因，因此導(dǎo)致該基因G+C含量較高。根據(jù)本研究結(jié)果，鹿科和牛科動(dòng)物IGF-1基因核苷酸序列中共檢測(cè)到20個(gè)變異位點(diǎn)，其中梅花鹿與馬鹿間變異位點(diǎn)較少，相似性達(dá)到99.4%，胡薇等[8]對(duì)梅花鹿IGF-1基因克隆測(cè)序表明，梅花鹿與馬鹿IGF-1基因核苷酸序列同源性達(dá)到99.78%，與本研究結(jié)果相似；而山羊和綿羊之間存在8個(gè)變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)與IGF-1基因的表達(dá)產(chǎn)物以及與鹿科和?？莆锓N表型差異的關(guān)系將是我們今后的工作目標(biāo)。此外，從IGF-1基因編碼區(qū)密碼子堿基的分布情況可以看出，鹿科和?？苿?dòng)物該基因存在相同的變化規(guī)律并且密碼子第3位的變異率明顯高于第1和第2位，符合搖擺假說(shuō)(wobble hypothesis)，即密碼子第3位堿基允許有一定程度的擺動(dòng)[12]。這與李鵬飛等[13]分析魚(yú)類(lèi)線粒體DNA Cyt b基因序列密碼子組成特點(diǎn)的研究結(jié)果一致。

圖3 NJ法構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Molecular phylogenetic tree by NJ method

圖4 UPGMA法構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Molecular phylogenetic tree by UPGMA method

3.2 鹿科與牛科動(dòng)物的分子進(jìn)化分析

從動(dòng)物分類(lèi)學(xué)角度分析，本研究中梅花鹿和馬鹿屬于鹿科物種[14]，普通牛、水牛、山羊和綿羊同屬?？莆锓N，其中普通牛和水牛屬?？浦械呐喛疲窖蚝途d羊則屬于?？浦械难騺喛芠15]。眾多研究者以不同基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用不同方法對(duì)鹿科與牛科動(dòng)物的遺傳分化進(jìn)行了分析。Wada等[16]分別通過(guò)NJ和MP方法，構(gòu)建了包括鹿科和?？圃趦?nèi)的12個(gè)物種線粒體基因組核苷酸及其編碼氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)鹿科、牛亞科及羊亞科在不同的進(jìn)化枝上。Klungland等[17]利用核基因黑素皮質(zhì)激素受體-1(MC1R)基因分析了鹿科與牛科動(dòng)物的遺傳分進(jìn)化關(guān)系，表明鹿科和牛科動(dòng)物的MC1R基因核苷酸歧異度為5.3%～6.8%，構(gòu)建的有根進(jìn)化樹(shù)與當(dāng)前動(dòng)物分類(lèi)學(xué)一致。侯佩興等[18]研究表明，偶蹄目動(dòng)物的性別決定(Sex-determining Region of Y-chromosome，SRY)基因按照其所處的科聚成了2類(lèi)，即鹿科和?？?。本研究以GenBank中公布的2種鹿科動(dòng)物和4種?？苿?dòng)物IGF-1基因編碼氨基酸序列為研究對(duì)象，分別通過(guò)NJ和UPGMA兩種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析鹿科和牛科動(dòng)物的分子進(jìn)化關(guān)系，表明梅花鹿與馬鹿間的遺傳距離最短且普通牛、水牛與山羊、綿羊分屬兩個(gè)不同的亞科。本研究結(jié)果與前人研究基本一致，進(jìn)一步解釋了物種間的分化程度與堿基序列差異之間存在相關(guān)性，同時(shí)也證明了通過(guò)核內(nèi)基因來(lái)分析鹿科和?？苿?dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化的可行性。

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SequenceComparisonandMolecularEvolutionAnalysisofIGF-1GeneofCervidaeandBovidaeSpecies

SONG Xing-chao,XU Chao,WANG Lei,Ba Heng-xing,WANG Gui-wu,YANG Fu-he*

(StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology,InstituteofSpecialAnimalandPlantScienceofCAAS,Changchun,Jilin130112,China)

Based on the IGF-1 gene nucleotide and amino acid sequences ofCervusnppon,Cervuselaphus,Bostaurus,Bubalusbubalis,Caprahircusand Ovis aries registered in GenBank,sequence variation and molecular evolution of IGF-1 gene were analyzed by means of bioinformatics software.The results showed that the lengths of IGF-1 gene coding sequences of Cervidae and Bovidae species were both 465 bp with the base composition being G>C>A>T and the content of G+C higher than that of A+T.Tthe first position of IGF-1 gene codon of the 6 species were rich in A,and the four bases in the second position were relatively even in distribution.A higher content of C in the third position.A total of 20 polymorphic sites including 10 singleton sites and 10 parsimony informative sites were detected among the 6 species,and a greater similarity of nucleotide and amino acid sequence in Cervidae and Bovidae species was observed.According to the molecular evolutionary tree constructed by NJ and UPGMA method,the 6 species fell into two broad categories: Cervidae and Bovidae with Bovidae including Bovidae and Capinae.

cervidae；bovidae；IGF-1 gene；sequence comparison；codon

2013-09-26，

2013-12-09

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB722907);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI03B02)

宋興超(1982-)，男，河北保定人，在讀博士，助理研究員，研究方向：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種。E-mail：tcssxc@126.com

*[通訊作者]楊福合(1956-)，男，河北人，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)及遺傳育種。E-mail：yangfh@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)03-0014-05