孟浩浩　許瑞霞　石國慶等

摘要：利用PCR-SSCP方法檢測了阿勒泰羊和新疆細毛羊ASIP基因的多態(tài)性位點，并分析各 SNPs 位點與被毛毛色之間的關(guān)系。結(jié)果表明，阿勒泰羊ASIP基因外顯子2（g.100～104 bp）存在 5 堿基丟失（D5：AGGAA），外顯子4（g.5172 bp：T→A）存在非同義性突變（Ser→Cys）；新疆細毛羊中只發(fā)現(xiàn)ASIP基因外顯子 2（g.100～104 bp）存在 5 堿基丟失（D5：AGGAA）；阿勒泰羊ASIP基因2處SNPs與被毛毛色不相關(guān)（P>0.05），而新疆細毛羊ASIP基因5堿基丟失與被毛毛色極顯著相關(guān)（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：新疆細毛羊；阿勒泰羊；ASIP基因；SNPs；毛色；PCR-SSCP

中圖分類號： S813.8；S826.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0042-04

收稿日期：2013-10-14

基金項目：國家“863”計劃（編號：2011AA100307-06）；國家科技支撐計劃（編號：2011BAD28B05-1）；國家自然科學基金（編號：31001002、31360540）。

作者簡介：孟浩浩（1988—），男，江蘇豐縣人，碩士研究生，主要從事綿羊毛色相關(guān)基因的篩選與鑒定研究。E-mail：576270343@qq.com。

通信作者：代蓉，副研究員，主要從事綿羊育種及養(yǎng)羊技術(shù)推廣等工作。Tel：（0993）6683760；E-mail：dairong1@163.com。哺乳動物體內(nèi)的色素分布廣泛、種類多樣，大量研究表明，黑色素細胞產(chǎn)生的酪氨酸源性色素（真黑素、褐黑素）是影響皮毛顏色的主要因素[1]。褐黑素為溶于堿的圓形紅色顆粒，使皮膚、毛發(fā)表現(xiàn)為黃色、紅色；真黑素比褐黑素難溶解，使皮膚和毛發(fā)表現(xiàn)為黑色、褐色[2]。動物表皮和毛囊中真黑色素、褐黑素的相對表達量最終決定了動物毛色。

ASIP是影響綿羊毛色的主要候選基因，在色素形成中起重要的調(diào)控作用[3]。它與α-促黑色素細胞激素（α-MSH）競爭結(jié)合黑素皮質(zhì)激素受體1（melanocortin-1，MC1R），使MC1R結(jié)構(gòu)改變，抑制環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶系統(tǒng)，引起cAMP 水平下降，通過級聯(lián)反應，促進褐黑素的產(chǎn)生[4-5]。ASIP基因在綿羊基因組中存在多個拷貝和等位基因[6]，編碼的鼠灰信號蛋白由133個氨基酸殘基組成。在研究藏羊、哈爾達綿羊等品種時發(fā)現(xiàn)，ASIP基因與綿羊的毛色相關(guān)。人、馬、牛、羊駝、兔、狗等物種ASIP基因多態(tài)性位點與毛色和膚色之間關(guān)系的研究已有大量報道，研究發(fā)現(xiàn)突變位點與毛色相關(guān)，但目前尚未深入探討細毛羊該基因與毛色形成的關(guān)系。因為細毛羊經(jīng)長期選育均為白色個體，由于生物多樣性和種質(zhì)特性的關(guān)系，其他綿羊、山羊的研究結(jié)果并不能完全反映新疆細毛羊中該基因的特點。筆者長期從事優(yōu)質(zhì)細毛羊的選育研究，在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)了自然突變的黑色細毛羊個體，這為開展ASIP基因與細毛羊毛色形成的關(guān)系提供了極好的試驗樣本。本研究以新疆細毛羊及阿勒泰羊為模型，探究 ASIP 基因SNPs 位點與綿羊毛色的關(guān)系，以期為探明綿羊毛色形成的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣本采集及 DNA 提取

采集新疆農(nóng)墾科學院試驗羊場成年阿勒泰羊（黃色、白色各 1 只，黑色 11 只，棕色 96 只）及新疆細毛羊（棕色5只，白色60只）耳緣組織（圖1），利用酚-氯仿法提取組織DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測的合格樣品放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

蛋白酶K、無水乙醇、Tris-飽和酚、氯仿、常規(guī)PCR試劑（TaKaRa），瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（Sigma公司），DL 100 bp Marker（天根 Code：DM109），變性加樣緩沖液[甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA（pH值 8.0）、 0.25%溴酚藍、 0.25%二甲苯青]、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根 Code：DP209）。

1.3引物設計

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中綿羊 ASIP基因（Genbank 登錄號：EU420022）設計引物（表 1），這3對引物分別位于ASIP基因的外顯子 2、3、4上，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.4ASIP基因核苷酸多態(tài)性分析

2.4ASIP各基因型頻率與基因頻率

從表3、表4可知，本研究中檢測到阿勒泰羊、新疆細毛羊外顯子2有2種基因型（N5N5、N5D5），在阿勒泰羊中N5N5基因型頻率較高，而新疆細毛羊中結(jié)果恰好相反。經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，該基因型與阿勒泰羊毛色不存在相關(guān)性（P>0.05），但與新疆細毛羊毛色顯著相關(guān)（P<0.01）。外顯子4中檢測到2種基因型（AB、BB），經(jīng)卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，該位點基因型與2種綿羊的毛色不相關(guān)（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

阿勒泰羊毛色以棕紅色或淡棕色為主，純黑、純白、純黃的阿勒泰羊不多[7]；新疆細毛羊以白色為主，黑色或其他毛色的新疆細毛羊稀少。在本研究樣品中，棕色阿勒泰羊和白色新疆細毛羊占多數(shù)，純黑、純白、純黃的阿勒泰羊及棕色細毛羊個體數(shù)較少。為使研究結(jié)果更為直觀，本研究沒有采集頭部、四肢與身體毛色相異的阿勒泰羊組織樣。

ASIP是影響綿羊毛色的主要候選基因，在綿羊基因組中存在多個拷貝和等位基因[6]。ASIP 編碼的鼠灰信號蛋白由133個氨基酸殘基組成，在不同品種綿羊中 SNPs 位點存在差異：藏羊的ASIP基因外顯子 2 只存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）的丟失[8]；澳大利亞美利奴綿羊[6]、哈薩克羊[9]外顯子 2 既存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丟失，又存在 9 bp（g.10～19 bp：AGCCGCCTC）丟失。研究表明，美利奴羊的顯性白色受 ASIP基因、AHCY 編碼區(qū)及 ITCH 啟動子區(qū)域的影響，多拷貝的ASIP基因編碼區(qū)受臨近的多個ITCH啟動子調(diào)控，導致顯性白色表型[6]；有關(guān)藏羊毛色與ASIP基因拷貝數(shù)的研究表明，藏羊純白與純黑表型與ASIP基因拷貝數(shù)不相關(guān)[8]。本研究結(jié)果與以往對藏羊[8]、美利奴羊[6]、哈薩克羊[9]的研究結(jié)果一致：ASIP基因外顯子 3中沒有發(fā)現(xiàn) SNPs位點。阿勒泰羊ASIP基因外顯子 2 存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丟失，這與已往研究結(jié)果相同。但在供試阿勒泰羊、新疆細毛羊樣品中沒有發(fā)現(xiàn)該品種綿羊存在 9 bp丟失，可能是由于部分毛色表型的羊個體數(shù)較少，致使其沒有被檢測到，可通過擴大樣品量再篩查。

參考文獻：

[1]劉琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（8）：37-38.

[2]龐有志.兔的毛色遺傳與家兔育種[J]. 中國養(yǎng)兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吳宇婷. 哺乳動物毛色形成機制與影響因素[J]. 四川動物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，趙志軍，賀俊平，等. Agouti在不同顏色被毛羊駝皮膚組織中的表達[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品種遺傳資源調(diào)查報告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韓吉龍，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信號蛋白基因（Agouti）的多態(tài)性及不同顏色被毛皮膚組織中Agouti與小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因（MITF）表達的定量分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪濤，曾獻存，張文祥，等. 哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態(tài)性及表達量與被毛顏色表型相關(guān)性的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（3）：366-375.

[10]夏熱甫·居馬依，劉江虎，古麗沙拉·加別力. 關(guān)于阿勒泰羊品種發(fā)展趨勢的探討[J]. 新疆畜牧業(yè)，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提漢，楊菊清，等. 新疆細毛羊滄桑五十年[J]. 中國草食動物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王樂，高維明，鄭文新，等. 新疆富蘊縣阿勒泰羊毛絨品質(zhì)分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.

參考文獻：

[1]劉琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（8）：37-38.

[2]龐有志.兔的毛色遺傳與家兔育種[J]. 中國養(yǎng)兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吳宇婷. 哺乳動物毛色形成機制與影響因素[J]. 四川動物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，趙志軍，賀俊平，等. Agouti在不同顏色被毛羊駝皮膚組織中的表達[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品種遺傳資源調(diào)查報告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韓吉龍，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信號蛋白基因（Agouti）的多態(tài)性及不同顏色被毛皮膚組織中Agouti與小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因（MITF）表達的定量分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪濤，曾獻存，張文祥，等. 哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態(tài)性及表達量與被毛顏色表型相關(guān)性的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（3）：366-375.

[10]夏熱甫·居馬依，劉江虎，古麗沙拉·加別力. 關(guān)于阿勒泰羊品種發(fā)展趨勢的探討[J]. 新疆畜牧業(yè)，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提漢，楊菊清，等. 新疆細毛羊滄桑五十年[J]. 中國草食動物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王樂，高維明，鄭文新，等. 新疆富蘊縣阿勒泰羊毛絨品質(zhì)分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.

參考文獻：

[1]劉琳玲，邢秀梅，王桂武，等. Agouti基因的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（8）：37-38.

[2]龐有志.兔的毛色遺傳與家兔育種[J]. 中國養(yǎng)兔，2008（10）：30-35.

[3]Royo L J，Alvarez I，Arranz J J，et al. Differences in the expression of the ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed[J]. Animal Genetics，2008，39（3）：290-293.

[4]吳宇婷. 哺乳動物毛色形成機制與影響因素[J]. 四川動物，2011，30（6）：1003-1007.

[5]姜俊兵，趙志軍，賀俊平，等. Agouti在不同顏色被毛羊駝皮膚組織中的表達[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：38-41.

[6]Norris B J，Whan V A. A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep[J]. Genome Research，2008，18（8）：1282-1293.

[7]王大星，徐冬. 阿勒泰羊品種遺傳資源調(diào)查報告[J]. 草食家畜，2009（2）：38-40.

[8]韓吉龍，岳耀敬，裴杰，等. 藏羊刺鼠信號蛋白基因（Agouti）的多態(tài)性及不同顏色被毛皮膚組織中Agouti與小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因（MITF）表達的定量分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2013，21（3）：338-347.

[9]李洪濤，曾獻存，張文祥，等. 哈薩克綿羊MC1R和ASIP基因多態(tài)性及表達量與被毛顏色表型相關(guān)性的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2013，44（3）：366-375.

[10]夏熱甫·居馬依，劉江虎，古麗沙拉·加別力. 關(guān)于阿勒泰羊品種發(fā)展趨勢的探討[J]. 新疆畜牧業(yè)，2011（3）：43-44.

[11]巴登加甫，木拉提漢，楊菊清，等. 新疆細毛羊滄桑五十年[J]. 中國草食動物，2006，26（1）：38-39.

[12]Fontanesi L，Dallolio S，Beretti F，et al. Coat colours in the Massese sheep breed are associated with mutations in the agouti signalling protein（ASIP） and melanocortin 1 receptor（MC1R） genes[J]. Animal，2011，5（1）：8-17.

[13]王樂，高維明，鄭文新，等. 新疆富蘊縣阿勒泰羊毛絨品質(zhì)分析[J]. 草食家畜，2011（2）：31-32.