任軍方+姜殿強(qiáng)+云勇

摘要：以海南省特有安諾蘭為基因組材料，采用改進(jìn)的CTAB法提取安諾蘭葉片中的基因組DNA，通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中各影響因子進(jìn)行優(yōu)化和篩選，建立適合海南安諾蘭的ISSR-PCR反應(yīng)體系：15 μL PCR反應(yīng)體積，10×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.5 mmol/L Mg2+，1.0 U Taq DNA聚合酶，40 ng模板DNA。

關(guān)鍵詞：安諾蘭；ISSR-PCR；優(yōu)化

中圖分類號(hào)： Q949.718.43；S682.310.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0039-03

收稿日期：2013-10-17

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：310062）。

作者簡(jiǎn)介：任軍方（1980—），女，河北石家莊人，助理研究員，研究方向?yàn)闊釒Щɑ芊N質(zhì)資源學(xué)。E-mail：renjunfang808@163.com。

通信作者：云勇，副研究員，研究方向?yàn)闊釒ё魑锓N質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。E-mail：yyong-3027@163.com。安諾蘭[Anota hainanensis （Rolfe）Schltr]為蘭科安諾蘭屬植物，海南省特有種，產(chǎn)于海南省中南部低海拔丘陵地區(qū)，熱帶附生蘭，附生于低海拔丘陵地區(qū)的楓樹上。安諾蘭在春節(jié)前后開花，花朵清麗、密集而芳香，是極好的新春賀歲花卉。

ISSR（inter simple sequence repeat）標(biāo)記即簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間DNA標(biāo)記，是由Zietkiewicz等于1994年提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[1]，它利用基于SSR而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物來(lái)檢測(cè)2個(gè)SSR之間的一段短DNA序列差異。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是所需DNA量少、多態(tài)性好、無(wú)須預(yù)知研究對(duì)象基因組序列等[2]，因此該技術(shù)已被廣泛用于品種鑒定[3]、基因定位及遺傳多樣性分析[4-5]。由于ISSR技術(shù)也是基于PCR的一種分子標(biāo)記技術(shù)，所以它同其他分子標(biāo)記技術(shù)一樣，結(jié)果容易受多種因素干擾，如模板DNA濃度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物濃度等都能影響擴(kuò)增結(jié)果，甚至其中一個(gè)因素改變都會(huì)影響擴(kuò)增條帶的位置或使其消失，從而影響整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，因此在研究時(shí)應(yīng)先建立合適的反應(yīng)體系并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化[6-10]。本研究對(duì)海南省特有安諾蘭ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行探索，旨在建立適于安諾蘭的ISSR反應(yīng)體系。

1材料與方法

1.1材料

供試安諾蘭來(lái)自于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所蘭圃，試驗(yàn)地點(diǎn)在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.2試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA marker等試劑均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）提供的序列，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1采用改良CTAB法提取DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以DL 2000為標(biāo)準(zhǔn)，檢查所得DNA的分子量、含量、純度、完整性，并將DNA濃度稀釋至40 ng/μL。

1.3.2ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用正交試驗(yàn)建立 ISSR-PCR 反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化，參照陶興林等的方法[11-15]設(shè)置各個(gè)因素，考察模板DNA濃度、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物濃度等4個(gè)因素對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響，設(shè)定5個(gè)水平，建立U20（54）均勻設(shè)計(jì)表（表1、表2），確立海南安諾蘭 ISSR-PCR 反應(yīng)體系，每個(gè)處理重復(fù)2次。

3結(jié)論與討論

ISSR技術(shù)已被廣泛用于植物種質(zhì)資源鑒定、植物遺傳多樣性等研究。ISSR擴(kuò)增以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，因此影響PCR擴(kuò)增的因素如引物濃度、dNTPs濃度、模板濃度等都會(huì)對(duì)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)生影響。植物種類、試驗(yàn)條件不同，各因子間相互影響產(chǎn)生的擴(kuò)增結(jié)果也不相同，本研究中不同處理下的擴(kuò)增條帶存在差異，因此須要對(duì)這些因子進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳組合。DNA Taq酶濃度是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素，其濃度過(guò)高容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過(guò)低時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物效率下降。dNTPs濃度太高容易引起錯(cuò)配，濃度過(guò)低會(huì)影響擴(kuò)增效率。引物濃度則會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量，濃度偏高會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度太低則無(wú)法進(jìn)行有效擴(kuò)增。另外，退火溫度、循環(huán)次數(shù)等也是反應(yīng)體系建立和優(yōu)化的重要因素[16-17]。

本研究采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)PCR各單因子進(jìn)行研究，建立了適合海南安諾蘭的ISSR反應(yīng)體系，即：總體積15 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+）2.0 μL，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.0 U Taq DNA聚合酶，模板DNA 40 ng，其他為超純水。并用ISSR引物823檢驗(yàn)了該體系的穩(wěn)定性和可靠性，為海南安諾蘭的種質(zhì)資源分析奠定了基礎(chǔ)。

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