寧殿賓，陳英敏，暴 雷

河北省人民醫(yī)院普外一科 石家莊 050051

乳癌患者原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶中VEGF與Cath-D蛋白的表達(dá)

寧殿賓△，陳英敏，暴 雷

河北省人民醫(yī)院普外一科 石家莊 050051

△男，1973年10月生，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：乳腺腫瘤，E-mail：ningdianbin@163.com

乳癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；組織蛋白酶D；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

目的：檢測(cè)乳癌患者原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶中VEGF、組織蛋白酶D(Cath-D)蛋白的表達(dá)。方法采用免疫組化SP法檢測(cè)38例乳癌患者(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例)和22例乳癌胸壁復(fù)發(fā)患者(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例)原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶及有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)。結(jié)果正常乳腺組織，乳癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.029和24.461，P<0.05)，且乳癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)均高于正常乳腺組織，但二組織間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳癌患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=9.017和5.963，P<0.05)。乳癌組織中VEGF和Cath-D蛋白的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(rP=0.411,P<0.001)。結(jié)論乳癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌組織中VEGF與Cath-D蛋白高表達(dá)，二者可能在乳癌復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年女性乳癌發(fā)病16.9萬(wàn)，死亡約4.5萬(wàn);乳癌居女性常見惡性腫瘤的第2位，居女性常見惡性腫瘤死亡原因的第6位[1]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)是乳癌預(yù)后的重要影響因素之一。惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移受多種因素的影響，是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，與腫瘤的血管生成密切相關(guān)。近年來(lái)，VEGF、組織蛋白酶D(cathepsin-D,Cath-D)作為判斷乳癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)而備受關(guān)注[2-4]。作者應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)了乳癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶以及有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌組織中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)，分析其相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇河北省人民醫(yī)院2001年1月至2012年12月行手術(shù)治療的乳癌患者，均為女性，其中乳癌原發(fā)患者38例，乳癌胸壁復(fù)發(fā)患者22例；原發(fā)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例,復(fù)發(fā)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者5例；年齡28～64歲，平均年齡52歲；Ⅰ期8例,Ⅱ期30例,Ⅲ期22例；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌35例，浸潤(rùn)性小葉癌25例。同時(shí)選取38例乳癌原發(fā)患者手術(shù)切除的癌旁正常乳腺組織作為對(duì)照。

1.2Cath-D和VEGF的免疫組化SP法檢測(cè)術(shù)中切除的乳癌原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，4 μm連續(xù)切片，保存待測(cè)。采用免疫組化SP法進(jìn)行染色，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。Cath-D 和鼠抗人VEGF 單抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)均按1:100稀釋。主要步驟:切片脫蠟、水化后以體積分?jǐn)?shù)3%H2O2孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶; 抗原修復(fù)后分別滴加一抗，37 ℃ 孵育1～2 h 或過夜，PBS 沖洗，5 min×3次; 滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 沖洗，5 min×3 次; 滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育20～30 min，PBS 沖洗，5 min×3次; DAB顯色; 自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)均由同一病理技師操作。

1.3結(jié)果判斷每張切片由2名醫(yī)生雙盲觀測(cè)。Cath-D 蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。選取8個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)8個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，除以細(xì)胞總數(shù)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞百分比<20%為陰性，≥20%為陽(yáng)性。VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合計(jì)分。選取5個(gè)高倍鏡視野，同上計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0 分，≤25%計(jì)1分，～50%計(jì)2分，～75%計(jì)3分，﹥75%計(jì)4 分; 著色強(qiáng)度以多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色計(jì)分，無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；2項(xiàng)計(jì)分相加，0～2分為陰性，≥3 分為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.5處理數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶、正常乳腺組織以及有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌組織中VEGF和Cath-D蛋白的表達(dá)，采用列聯(lián)系數(shù)分析乳癌組織中VEGF和Cath-D蛋白表達(dá)的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常乳腺組織、乳癌原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶組織中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)比較見表1。由表1可以看出，乳癌復(fù)發(fā)灶和乳癌原發(fā)灶組織中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)較正常乳腺組織增強(qiáng)。

2.2乳癌患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)比較見表2。由表2可以看出，乳癌患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組增強(qiáng)。

表1 3種組織中VEGF、Cath-D蛋白的表達(dá) 例(%)

*:與正常乳腺組織相比，P<0.017。

表2 乳癌患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、 Cath-D蛋白的表達(dá) 例(%)

2.3乳癌組織中VEGF、Cath-D蛋白表達(dá)的關(guān)系見表3。

表3乳癌組織中VEGF、Cath-D蛋白表達(dá)的關(guān)系例

VEGFCath?D陽(yáng)性陰性陽(yáng)性427陰性47

rP=0.411,P<0.001。

3 討論

乳癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多方面因素的過程，其中腫瘤細(xì)胞的過度增殖及新血管的生成是重要的影響因素。腫瘤的生長(zhǎng)依賴腫瘤新生血管的形成，血管生成對(duì)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。VEGF是重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子和最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂劑。有研究[3]結(jié)果顯示VEGF 是促進(jìn)乳癌血管生成的重要調(diào)節(jié)因子；微血管最豐富區(qū)位于乳腺惡性腫瘤與正常組織交界區(qū)。李穎嘉等[4]研究發(fā)現(xiàn)乳腺惡性腫瘤組VEGF及其主要受體Flk-1/KDR 的表達(dá)、MVD 計(jì)數(shù)均顯著高于良性腫瘤組；VEGF 能特異性地刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，具有促血管通透性作用，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)。該研究中乳癌原發(fā)組織及復(fù)發(fā)組織VEGF蛋白的表達(dá)均高于正常乳腺組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF蛋白的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與國(guó)內(nèi)研究[5-6]結(jié)果一致。這說明VEGF 蛋白表達(dá)增高可促進(jìn)乳癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示VEGF促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤血管數(shù)量增加，為乳癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通道。

Cath-D是相對(duì)分子質(zhì)量為34 000的蛋白。它低濃度存在于各種細(xì)胞胞質(zhì)中,在正?；蛐∪~增生的乳腺組織中濃度都很低[7]。Cath-D 能刺激細(xì)胞生長(zhǎng), 活化后可以直接催化基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞移動(dòng)的通道，并間接破壞血管基膜[8]。Cath-D還可以激活Cath-B，誘導(dǎo)產(chǎn)生活化的尿激酶型-纖溶酶原激活劑，后者也具有與Cath-D相似的功能。該研究結(jié)果顯示乳癌原發(fā)組織及復(fù)發(fā)組織Cath-D蛋白的表達(dá)均高于正常乳腺組織，而且乳癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Cath-D蛋白的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示Cath-D在乳癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。有研究[9-10]顯示，Cath-D可作為上游基因調(diào)節(jié)MMP-2 表達(dá)，MMP-2可以啟動(dòng)MMPs 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)ECM 降解，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向周圍組織及淋巴結(jié)播散，同時(shí)MMP-2 可以啟動(dòng)血管生成，直接促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)生血道轉(zhuǎn)移。于湛等[11]在對(duì)胃癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Cath-D蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)轉(zhuǎn)移組，推測(cè)Cath-D蛋白可刺激癌細(xì)胞生長(zhǎng), 降解并破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì), 為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供條件。

另外，該研究結(jié)果還顯示VEGF、Cath-D在乳癌組織中同時(shí)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，存在正關(guān)聯(lián)，提示它們可能在乳癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，乳癌原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳癌組織中VEGF與Cath-D蛋白高表達(dá)，二者可能在乳癌復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用。聯(lián)合檢測(cè)VEGF、Cath-D的表達(dá)在判斷乳癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后方面有重要的臨床意義。

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(2013-11-07收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Expressions of VEGF and Cath-D in primary and recurrent focuses from patients with breast cancer

NINGDianbin,CHENYingmin,BAOLei

DepartmentofGeneralSurgery,HebeiProvincialPeople'sHospital,Shijiazhuang050051

breast cancer; VEGF; Cath-D; lymph node metastasis

Aim: To investigate the expressions of VEGF and Cath-D in primary and recurrent focuses from patients with breast cancer. Methods: Immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of VEGF and Cath-D in 38 cases of breast cancer(25 with lymph node metastasis) and 22 cases of recurrent breast cancer(5 with lymph node metastasis).Results: The expressions of VEGF and Cath-D in primary focuses and recurrent focuses had no significant difference, but both of them were higher than normal breast tissue(χ2=50.029 and 24.461，P<0.05). The expressions of VEGF and Cath-D in breast cancer tissue with lymphatic metastasis were higher than that of without lymphatic metastasis(χ2=9.017 and 5.963，P<0.05). The expressions of VEGF and Cath-D in breast cancer tissue were positively associated(rP=0.411,P<0.001). Conclusion: There are high expressions of VEGF and Cath-D in primary， recurrent focuses and breast cancer tissue with lymph node metastasis from patients with breast cancer,and they may have synergetic effect on the recurrence and lymphatic metastasis of breast cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.034

R737.9