周 瑞，成宏偉，戴曉榮，周正斌，陳永康

(揚(yáng)州大學(xué)附屬泰興人民醫(yī)院，消化內(nèi)科，江蘇 泰興，225400)

AMP-18是新發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)胃腸黏膜有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，其生理功能主要有促進(jìn)胃腸黏膜上皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞的遷徙，促進(jìn)胃腸黏膜損傷的修復(fù)等[1-4]。炎癥性腸病(IBD)指潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD),是病因不明的慢性腸道炎癥性疾病。由于IBD呈慢性反復(fù)發(fā)作過(guò)程，治愈十分困難,常給患者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。目前治療藥物以抗炎、抑制免疫為主，但存在局限。因此，對(duì)于IBD的治療而言，除抑制或減輕損傷以外，加強(qiáng)黏膜保護(hù)或促進(jìn)損傷修復(fù)同樣重要，至少應(yīng)與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。本試驗(yàn)觀察 AMP-18對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠是否具有腸黏膜保護(hù)作用，及其與5-ASA合用是否可增強(qiáng)療效,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

AMP-18購(gòu)自北京大學(xué)生命科學(xué)院; 5% 2，4，6TNBS和5-ASA均購(gòu)自德國(guó)Sigma公司; S-P免疫組化染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司；MPO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠NF-KBp65單克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品。大鼠EGF的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL(Adlitteram Diagnostic Laboratories)公司。

1.2 TNBS結(jié)腸炎動(dòng)物模型制備及處理

40只Sprague-Dawley(SD)成年雌雄大鼠，體質(zhì)量165～210 g,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。置于溫度為(23±1) ℃的凈化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，混合食料喂養(yǎng)，常規(guī)性適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)抽取10只為正常對(duì)照組A組(雌雄各半)，剩余30只隨機(jī)分成B、C、D組，每組盡量保證雌雄均衡。按文獻(xiàn)方法建立大鼠結(jié)腸炎模型：實(shí)驗(yàn)前1 d禁食，用2%異戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，用金屬灌腸管經(jīng)大鼠肛門插入結(jié)腸深約8 cm，一次性注入TNBS/乙醇溶液0.6 mL制模(按100 mg/kg TNBS加上50%乙醇0.25 mL)，然后注入0.3 mL的空氣，盡可能將黏附在灌腸管及注射器上的藥液注入大鼠腸內(nèi)。制模后第3天，各組分別給予不同處理: ① A組給予0.9%氯化鈉溶液1 mL灌腸; ② B組給予5-ASA 1 mL灌腸(100 mg/kg); ③ C組給予AMP-18 10 mg/kg，皮下注射; ④ D組給予5-ASA和AMP-18各1 mL聯(lián)合處理。

1.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

大鼠的一般狀況：觀察精神狀態(tài)、毛發(fā)變化、活動(dòng)狀態(tài)、大便變化、體質(zhì)量等。并進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分：給藥后第4、8天分別處死每組大鼠5只，取末端10 cm的結(jié)直腸沿腸系膜縱行剖開(kāi)，觀察大體形態(tài)改變，按Wallace-Keenan標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大體評(píng)分。大鼠結(jié)腸組織損傷評(píng)分：將結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行HE染色，采用Fedorak積分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。MPO活性檢測(cè)：取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織0.1 g，按質(zhì)量體積比為1∶19加入均漿介質(zhì)1.9 mL制備成5%的組織勻漿液。取5%組織勻漿液0.9 mL按試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。用UV-240IPC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)460 nm，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零,測(cè)定各管吸光度(A)值，計(jì)算酶活力單位。每克組織在37 ℃的反應(yīng)體系中被H2O2分解1 μmol為1個(gè)酶活力單位。結(jié)腸組織NF-kB免疫組化染色分析：取結(jié)腸病變部位組織，4%中性甲醛固定后石蠟包埋。將用黏片劑多聚賴氨酸處理后的玻片，取4 μm厚組織切片作免疫組化染色。NF-κB免疫組化染色操作步驟按SP試劑盒進(jìn)行。結(jié)果判斷: 細(xì)胞呈棕黃色為陽(yáng)性，定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)。上皮細(xì)胞陽(yáng)性結(jié)果計(jì)算方法：隨機(jī)計(jì)數(shù)遠(yuǎn)端結(jié)腸(從肛門向上約4 cm)50個(gè)隱窩，計(jì)數(shù)每個(gè)隱窩的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，并按下述標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分: ≤5%為0分; 6%～25%為1分，記+; 26%～50% 為2分，記2+; 51%～75%為3分，記3+; 76%～100%為4分，記4+。之后計(jì)算每只大鼠的平均得分。血清EGF檢測(cè)：分別在用藥后第4、8天每組各抽取5只大鼠，心臟取血，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清EGF濃度。具體方法及操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用ANOVA分析后進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠灌腸后的一般狀況

造模后的大鼠均出現(xiàn)食量下降，解稀便或黏液血便等消化道癥狀以及精神萎靡、體質(zhì)量下降等全身改變。實(shí)驗(yàn)第0天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠平均體質(zhì)量為(185±8) g，灌腸給藥組為(194±9) g，2組間無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)第4、8天，A組大鼠體質(zhì)量平均減輕(10±2) g和(7±2) g，B、C和D組大鼠體質(zhì)量增加，但B、C組體質(zhì)量增加低于D組。

2.2 DAI評(píng)分

與對(duì)照組A組比較,給藥組 B、C、D組的評(píng)分明顯低于A組(P<0.05); 并且D組的評(píng)分明顯低于B組和C組(P<0.05),但給藥組B、C組之間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 大體形態(tài)損傷

大鼠結(jié)腸炎癥病變主要靠近肛門段結(jié)腸，病變黏膜充血、水腫、糜爛和潰瘍形成，部分腸壁增厚與周圍組織粘連。B、C、D組結(jié)腸炎癥病變明顯輕于A組(P<0.01)，其中又以D組為最輕，且各組結(jié)腸炎病變用藥第8天明顯低于第4天(P<0.05)。

2.4 結(jié)腸組織學(xué)損傷

TNBS/乙醇造模后,組織學(xué)檢查病變主要位于黏膜及黏膜下層,以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,亦可見(jiàn)數(shù)量不等的巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞,黏膜糜爛及潰瘍形成,且病變部位腺體排列不整齊，見(jiàn)圖1。與A組比較,B、C、D各組大鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)損傷明顯減輕,組織學(xué)損傷評(píng)分顯著降低(P<0.01),且D組最低 (P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 TNBS/乙醇造模后結(jié)腸組織學(xué)變化低倍鏡下觀察

表1 各組在各個(gè)時(shí)期的參數(shù)關(guān)系比較

2.5 結(jié)腸組織MPO水平測(cè)定結(jié)果

炎癥時(shí)，結(jié)腸組織中MPO水平增高；用藥第4天后有所下降，用藥第8天后下降更明顯(P<0.05)，且B、C、D組MPO水平較對(duì)照組A組下降更顯著 (P<0.01)，其中D組下降最明顯(P<0.05),但給藥組B、C組MPO下降水平比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.6 NF-kB免疫組化染色結(jié)果

NF-kB主要表達(dá)在黏膜上皮細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且靠近結(jié)腸潰瘍和糜爛部位陽(yáng)性率高，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)后第4、8天，A組大鼠結(jié)腸組織NF-kB表達(dá)水平較高，而B、C、D組NF-kB表達(dá)明顯降低，且D組大鼠結(jié)腸組織陽(yáng)性率最低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 NF-kB免疫組化染色結(jié)果

2.7 血清EGF濃度的測(cè)定結(jié)果

用藥組B，C，D的EGF的濃度明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A組，且聯(lián)合用藥組D組的EGF濃度明顯高于單獨(dú)給藥組B組或C組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)期各指標(biāo)表達(dá)情況

3 討 論

AMP-18是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)胃黏膜有保護(hù)作用的蛋白質(zhì),其主要生理功能為促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞的遷徙，促進(jìn)胃黏膜損傷的修復(fù)，保持胃黏膜的完整等[5]。但是，目前許多研究[6]顯示AMP-18亦能促進(jìn)腸黏膜損傷后的修復(fù)。Walsh-Reitz等[7]給小鼠皮下注射AMP-18后，發(fā)現(xiàn)可明顯延遲右旋糖酐硫酸酯鈉(DSS)引起的直腸黏膜損傷(如血便發(fā)生)的發(fā)生并可減少體質(zhì)量下降的程度。進(jìn)一步在細(xì)胞水平對(duì)上述現(xiàn)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)氯乙烷、吲哚美辛或DSS等黏膜損傷劑能引起人結(jié)腸上皮C2細(xì)胞單細(xì)胞層跨上皮電阻(TER)的下降,及細(xì)胞周圍緊密連接蛋白、結(jié)合前肌動(dòng)蛋白(perijunctional actin)含量的減少。而當(dāng)在該細(xì)胞培養(yǎng)基中預(yù)先加入AMP-18后可明顯減少黏膜損傷劑引起的TER下降，并促使TER的回復(fù)。此外，也能增加細(xì)胞周圍緊密連接(TJ)相關(guān)蛋白(occludin，claudin-5，ZO-1、ZO-2)、上皮細(xì)胞鈣黏蛋白的積累并減少它們的丟失，和通過(guò)穩(wěn)定結(jié)合前肌動(dòng)蛋白(perijunctional actin)來(lái)保持細(xì)胞層的完整性。由此可見(jiàn)，AMP-18對(duì)腸黏膜具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用AMP-18與5-ASA對(duì)TNBS誘發(fā)的大鼠結(jié)腸炎有良好的治療作用，其療效優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用AMP-18或5-ASA，提示AMP-18在TNBS誘發(fā)的大鼠結(jié)腸炎腸黏膜損傷修復(fù)中起重要作用。許多研究表明，炎癥性腸病病變以潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主。MPO是中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過(guò)氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中，可作為中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。Chadwick等研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜MPO可作為炎癥性腸病患者病情嚴(yán)重程度的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Saiki研究發(fā)現(xiàn)糞便中MPO活性是炎癥性腸病病情活動(dòng)的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)中模型組MPO水平明顯高于正常組，表明組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。給藥組MPO有不同程度下降，說(shuō)明AMP-18和5-ASA可降低MPO水平，減輕炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而減輕腸道炎癥。眾多資料顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜組織活檢中NF-KB p65亞單位表達(dá)明顯上調(diào)。NF-KB通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化(化學(xué))因子及其他炎性遞質(zhì)的調(diào)控在IBD炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。本組實(shí)驗(yàn)中作者觀察到炎癥時(shí)NF-kB表達(dá)增加，而應(yīng)用AMP-18治療后NF-kB表達(dá)下降，表明AMP-18可能通過(guò)NF-kB來(lái)發(fā)揮抗炎效應(yīng)，其與NF-KB之間可能存在互相調(diào)節(jié)作用。表皮生長(zhǎng)因子能促進(jìn)多種上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)黏膜細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，增加黏膜血流，促進(jìn)黏液分泌，減輕腹瀉等。Luck等對(duì)小鼠UC模型用EGF進(jìn)行治療,在UC形成后分別由直腸直接灌腸和體內(nèi)注射EGF治療7 d,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射EGF明顯減輕了結(jié)腸的潰瘍和炎癥,而且明顯減低了結(jié)腸組織中MPO的活性，說(shuō)明體內(nèi)注射EGF可以加快潰瘍的愈合并有效地減輕炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)AMP-18皮下注射和5-ASA灌腸治療后，EGF表達(dá)增強(qiáng)，且存在時(shí)間和協(xié)同效應(yīng)。在給藥3 d后EGF的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，治療1周后EGF表達(dá)上升更加明顯，且聯(lián)合應(yīng)用AMP-18和5-ASA灌腸治療組的EGF表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)應(yīng)用AMP-18和5-ASA治療組。這說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用AMP-18和5-ASA可以明顯上調(diào)EGF的表達(dá)，促進(jìn)受損區(qū)域上皮細(xì)胞的重建，加快上皮細(xì)胞的移行速度，從而促進(jìn)結(jié)腸炎損傷黏膜的愈合。

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