戢志呈，江雁翔，劉耀光，張群宇

(亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/華南農業(yè)大學 生命科學學院，廣東 廣州 510642)

應用Gibson Assembly方法構建植物表達載體

戢志呈，江雁翔，劉耀光，張群宇

(亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/華南農業(yè)大學 生命科學學院，廣東 廣州 510642)

【目的】構建方便快捷的植物表達載體.【方法】應用Isothermalinvitrorecombination system or “Gibson Assembly”方法設計包含片段間20～25 bp互補重疊序列的引物，通過PCR擴增出帶有首尾重疊的目的DNA片段，可將1個或多個片段和線性化的載體一步組裝成表達載體.【結果和結論】 利用該方法快速構建了多個水稻基因的全長以及部分缺失編碼區(qū)表達載體.此外，還通過對Gibson Assembly連接產物進行PCR擴增后再連接到載體，提高多DNA片段組裝的效率.本方法不受目的片段內部限制性酶切位點的限制，可廣泛應用于各種載體的構建.

Gibson Assembly； 體外重組； 植物表達載體構建

表達載體是研究目的基因功能和遺傳工程的重要工具，在亞細胞定位、目的基因表達、基因敲除、酵母雙雜交和單雜交、T-DNA插入突變等技術方法中廣泛應用.傳統載體的構建基于限制性內切酶和T4DNA連接酶的方法,它要求先從細胞或組織中分離目的基因的DNA片段，然后利用限制性內切酶切斷雙鏈DNA分子從而產生黏性末端或平末端.如果線性化載體也產生相同的末端，二者可以在T4DNA連接酶作用下重新形成磷酸二酯鍵，構成一個完整的DNA分子[1].此方法操作容易、但針對多個片段的連接，則需要進行多次的酶切連接，而且還受限于可利用的酶切位點.

Gibson Assembly方法是Gibson等[2]發(fā)明的將多個DNA片段在1次反應中實現分子間連接.此方法關鍵要求是連接片段與線性化載體首尾有一小段的互補重疊序列.利用T5核酸外切酶(T5 exonuclease)的5′→3′外切酶活性產生黏性末端，帶有互補的重疊序列DNA配對，再利用Phusion DNA polymerase 補齊片段上的缺口部分，最后通過TaqDNA Ligase將多個DNA片段連接起來.2009年Gibson等[3]應用Gibson Assembly方法設計40 bp的互補重疊序列合成了3個5 kb的片段，并且成功地插入到1個8 kb的細菌人工染色體上.2010年Gibson等[4]以600個含有60 bp互補重疊序列的片段利用Gibson Assembly方法采用三輪組裝的方法成功合成了16.3 kb的小鼠線粒體基因.Jiang 等[5]利用Gibson Assembly方法開發(fā)了一步法構建植物干涉載體的技術：從植物基因組中擴增出目標片段，一步法形成反向互補的發(fā)夾結構，并同時連接入干涉載體中.

本研究應用Gibson Assembly方法構建了1個水稻轉錄因子基因Os05g0144300的全長及其4個缺失突變植物轉化載體.另外，將從不同來源得到的啟動子PNos、目的基因ATP5-N和orfH79及終止子TNos這4個表達元件，一步法構建了水稻紅蓮型細胞質雄性不育基因orfH79表達載體.本研究可為Gibson Assembly方法應用于植物表達載體的構建提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：水稻‘中花11’和紅蓮型不育系‘粵泰A’ ，哥倫比亞型擬南芥.載體和菌株：pER8載體，pCAMBIA1300載體，大腸埃希菌DH10B均為華南農業(yè)大學遺傳工程實驗室保存.

1.2 Gibson Assembly方法反應體系

反應體系根據Gibson Assembly方法[6]和Jiang等[5]改良方法配制.2× IR Buffer(Enzyme-reagent mix): 320 μL 5× IR Buffer, 0.3 μL T5 exonuclease (10 U/μL) (Epicentre), 20 μL Phusion polymerase (2 U/μL) (NEB), 160 μLTaqligase (40 U/μL) (NEB), 加ddH2O至0.8 mL,分裝為5 μL的等份，-20 ℃條件下儲存.

1.3 Os05g0144300基因全長及缺失突變體載體的構建

Os05g0144300基因全長及缺失突變載體構建引物見表1.分別以水稻‘中花11’葉片抽提的基因組DNA和cDNA為模板PCR擴增Os05g0144300基因的啟動子和目的基因cDNA片段.PCR反應體系為：50 μL反應體系中加入2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，100 μmol/L Primer F 0.15 μL，100 μmol/L Primer R 0.15 μL，KOD FX 1 μL，模板1 μL,滅菌去離子水12.7 μL.PCR反應條件為:94 ℃預變性2 min; 98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸3 min，30個循環(huán);68 ℃延伸10 min.PCR產物電泳檢測，采用回收試劑盒(TaKaRa公司)進行純化回收后,加入10% 體積的3 mol/L NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，-80 ℃放置3 h，10 000 r/min 4 ℃離心沉淀，0.3 mol/L的TE溶解PCR產物,并置于-20 ℃條件下保存.

啟動子擴增的上下游引物為P-EcoRⅠF和P-EcoRⅠR.目的基因1～1 128氨基酸(aa)片段上下游引物為CDS-F、1 128 aaR，1～730 aa片段的上下游引物為CDS-F、730 aaR，1～869aa片段的上下游引物為CDS-F、869 aaR，1～443 aa片段的上下游引物為CDS-F、440 aaR，731～1 128 aa片段的上下游引物為731～1 128 aaF 、1 128 aaR，1～741 aa片段的上下游引物為CDS-F、741 aaR，870～1 128 aa片段的上下游引物為870～1 128 aaF、1 128 aaR.

用EcoRⅠ酶切質粒pCAMBIA1300，酶切50 μL反應體系：5 μL Buffer、12.5 μL質粒、0.5 μL內切酶、32 μL ddH2O，37 ℃酶切1.5 h后終止反應.酶切產物凝膠回收,純化,再乙醇沉淀純化.Gibson Assembly連接體系為10 μL：載體3 μL,克隆片段1 μL,混合酶6 μL，50 ℃反應20 min.連接產物電擊轉化DH10B，用質粒抽提試劑盒(TaKaRa公司)抽取陽性克隆質粒DNA進行EcoRⅠ酶切鑒定，并送上海美吉公司進行測序,測序正確后命名為PCP.

用SalⅠ對PCP質粒進行酶切，線性化后的載體與1～1 128 aa片段、1～730 aa片段 、1～869 aa片段用Gibson Assembly方法分別連接(方法同上).成功連接后質粒分別命名為PCP-1、PCP- 2、 PCP-3.線性化后的載體與1～443 aa片段、731～1 128 aa片段混合連接，成功連接后質粒命名為PCP- 4.線性化后的載體與1～741 aa、870～1 128 aa混合連接，成功連接后的質粒命名為PCP-5.

表1 Os05g0144300基因全長及缺失突變體載體引物Tab.1 Primers for a vector construction of the full-length and truncated Os05g0144300 gene

1) 引物序列中小寫字母堿基為引物的互補重疊序列.

1.4 orfH79表達載體的構建

orfH79表達元件組裝相關引物見表2.以pER8載體質粒為模板，PNos-F、PNos-R為引物擴增PNos,TNos-F、TNos-R為引物擴增TNos[7].以水稻紅蓮型‘粵泰A’葉片的 cDNA為模板，orfH79-F、orfH79-R為引物擴增orfH79 (GeneBank accession NO. AB254027.1)[8].以擬南芥葉片的cDNA為模板，ATP5N-F、ATP5N-R為引物擴增ATP5的線粒體定位信號肽序列ATP5-N(At5g13450)[9].

PNos 、ATP5-N、orfH79和TNos這4個片段用Gibson Assembly方法進行一次性連接，連接體系和連接條件同上.連接產物連接到T載體pMD?18-T(TaKaRa公司)轉化大腸埃希菌，以陽性克隆質粒為模板，擴增orfH79各表達元件進行PCR驗證并測序.

表2 orfH79表達元件擴增引物

1) 小寫字母為引物的互補重疊序列.

2 結果與分析

2.1 Os05g0144300基因的全長和缺失突變載體的構建

為了研究水稻轉錄因子Os05g0144300基因的功能，利用PCR從水稻‘中花11’的基因組DNA擴增出該基因編碼區(qū)上游的啟動子約3 000 bp，同時用EcoRⅠ酶切線性化pCAMBIA1300載體，采用Gibson Assembly方法將二者連接.成功連接的載體命名為PCP，EcoRⅠ酶切驗證結果顯示插入片段與目標分子大小一致 (圖1).

根據Os05g0144300蛋白質功能域預測結果，設計Os05g0144300基因全長和缺失突變表達載體(圖2).

從水稻‘中花11’ cDNA擴增出Os05g0144300基因全長1～1 128 aa片段3 384 bp 、1～730 aa片段2 100 bp、1～869 aa片段2 607 bp、1～443 aa片段1 329 bp、731～1 128 aa片段1 194 bp、1～741 aa片段2 223 bp、870～1 128 aa片段777 bp.用SalⅠ酶切線性化PCP質粒，將線性化的載體分別與1～1 128 aa片段、1～730 aa片段、1～869 aa片段連接，線性化的載體與1～443 aa片段、731～1 128 aa片段混合連接，線性化的載體與1～741 aa片段、870～1 128 aa片段混合連接，連接均采用Gibson Assembly方法進行.獲得的5個重組質粒PCP-1、PCP- 2、PCP-3、PCP- 4、PCP-5經限制性內切酶SalⅠ酶切鑒定，結果顯示其大小一致(圖3).

M: DNA marker DL15000；1：Os05g0144300基因啟動子片段的擴增；2:PCP質粒酶切.

圖1 PCP載體限制性內切酶EcoRⅠ酶切檢測結果

Fig.1 Electrophoresis results of PCP plasmid digested byEcoRⅠrestriction enzyme

圖2Os05g0144300基因全長結構和缺失突變載體示意圖

Fig.2 Schematic diagram of the construction of full-length and truncated rice geneOs05g0144300 expression vectors

M: DNA marker DL15000；1:1～1 128 aa；2：PCP-1酶切；3：1～730 aa；4：PCP- 2酶切；5：1～869 aa；6：PCP-3酶切；7：1～443 aa；8：731～1 128 aa；9：PCP- 4酶切；10：1～741 aa；11：870～1 128 aa；12：PCP-5酶切.

圖3Os05g0144300基因全長和缺失突變載體限制性內切酶SalⅠ酶切檢測結果

Fig.3 Electrophoresis results of plasmids of the full-length and truncated rice geneOs05g0144300 expression vectors digested bySalⅠ restriction enzyme

2.2 orfH79表達元件載體的構建

利用PCR從pER8載體擴增出PNos片段333 bp、TNos片段275 bp，從擬南芥的cDNA擴增出ATP5基因N端序列354 bp，從水稻紅蓮型不育系‘粵泰A’ 的cDNA擴增出orfH79基因598 bp.PNos、ATP5-N、orfH79、TNos這4個片段，用Gibson Assembly方法進行連接.鑒于多個DNA片段一次性連接到載體的方法雖然可以得到陽性克隆，但效率較低.我們對以上4個DNA片段利用Gibson Assembly方法進行連接后，取部分連接產物先進行一次PCR擴增，擴增產物命名為PAHT(約1 600 bp),再將PAHT連接到TA載體或植物表達載體上轉化大腸埃希菌(圖4).這種改良可以大大提高陽性克隆比率.挑取12個單菌落進行菌落PCR鑒定，結果顯示全部為陽性克隆.以陽性克隆質粒為模板，從中擴出orfH79各個表達元件以及PAHT,片段大小與預期相符(圖5).

圖4 orfH79表達元件載體構建示意圖

Fig.4 Schematic diagram of the construction oforfH79 expression vector

M:DNA marker DL2000；1：PNos；2：ATP5-N；3：orfH79；4：TNos；5：PAHT.

圖5orfH79表達元件載體各片段和組裝的完整表達框的PCR檢測

Fig.5 Detections of assembling fragments of theorfH79 expression vector by PCR

3 討論

傳統的載體構建基于酶切連接重組的經典克隆方法，但是該種方法在針對一些較長片段或多個DNA序列時，載體可供選擇的限制性酶切位點往往受到限制[10].采用Gibson Assembly方法僅需要對載體進行單酶切線性化，利用互補DNA序列可實現多段DNA序列的無縫連接，不需要依賴特定的酶切位點.本方法與傳統酶切連接方法相比有以下優(yōu)點：①傳統酶切連接方法需要較長的連接反應時間，而本方法只需溫浴20～30 min后即可轉化;②傳統酶切連接方法每次只能連接1個插入片段，多個片段的組裝需要逐次進行限制性內切酶酶切連接反應，隨著連接片段數目的增多，載體的多克隆位點將無法滿足插入片段的要求.而本方法只需對載體進行一種限制性內切酶酶切,獲得線性化載體，而插入片段不需要進行酶切產生相同的黏性末端，即對多克隆位點的要求很低;③減少了試驗操作步驟，由于插入片段的連接依賴于互補片段，而不是限制性內切酶酶切位點的黏性末端，減少了插入片段的酶切純化等步驟；④該方法的高效性還體現在對多個不同目的片段的克隆上：當需要用同一個載體對多個基因進行克隆時，僅需要在合成引物時在特異引物的末端加上載體線性化位點兩側的序列，而不需要分析目的片段的限制性內切酶酶切位點等信息，即可以工廠化進行多個載體的構建；另外，在實際的Gibson Assembly方法應用中，一次反應連接多個DNA片段時可能會出現效率下降，陽性克隆少的問題，我們對其進行改良，對多片段的連接產物進行1次PCR擴增后再連接到載體，大大提高了陽性克隆率.

應用Gibson Assembly方法，克隆片段的長度可以是幾百堿基，也可以達到900 kb[3]，甚至可以用于人工合成細菌的全基因組[11-12].Gibson Assembly方法已經應用于動物[4]、酵母基因組的克隆[2, 13-14].本研究應用該方法成功構建了Os05g0144300基因全長及缺失突變植物轉化載體和水稻紅蓮型不育系‘粵泰A’細胞質雄性不育基因orfH79表達元件載體，為同類植物表達載體的快速構建提供了方法借鑒.

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【責任編輯李曉卉】

ApplicationofGibsonAssemblymethodforplantexpressionvectorconstruction

JI Zhicheng, JIANG Yanxiang, LIU Yaoguang, ZHANG Qunyu

(State Key Laboratory of Subtropical Agro-bioresources Conservation and Utilization/College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

【Objective】 To construct a convenient and efficient plant expression vectors. 【Method】 Gibson et al developed an isothermalinvitrorecombination system or Gibson Assembly for ligation of multiple DNA fragments. The primers were designed to amplify target DNA sequences that contained 20-25 bp overlapping ends. The target DNA segments，linearized vector and the enzyme mixture were mixed in one tube to perform the assembly reaction.【Result and conclusion】 Using this method, several vectors for expressing rice genes were assembled. To increase the efficiency for cloning multiple fragments, the assembled primary products by PCR were amplified and then ligated into the vector. The Gibson Assembly method is faster and simpler without the limitation of internal restriction endonuclease sites of target genes, and it can be applied widely to construction of various vectors.

Gibson Assembly; isothermalinvitrorecombination system; plant expression vector construction

2013- 06- 06優(yōu)先出版時間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0922.041.html

戢志呈(1989—)，男，碩士研究生, E-mail: zhichengji@126.com；通信作者：張群宇(1973—)，男，副研究員，博士，E-mail: zqy@scau.edu.cn

國家自然科學基金(30871331)；973計劃項目(2011CB100204)

戢志呈，江雁翔，劉耀光，等.應用Gibson Assembly方法構建植物表達載體[J].華南農業(yè)大學學報，2014,35(5):112- 116.

Q754

A

1001- 411X(2014)05- 0112- 05