強 薇，郭 帥，張愛華，雷鋒杰，匙 坤，王 壯，王二歡，張連學

(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院, 吉林 長春 130118)

人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選

強 薇，郭 帥，張愛華，雷鋒杰，匙 坤，王 壯，王二歡，張連學

(吉林農(nóng)業(yè)大學 中藥材學院, 吉林 長春 130118)

【目的】篩選對人參主要病原菌拮抗率更高、抑菌譜更廣的新菌株生防菌種資源.【方法】稀釋平板法分離拮抗菌；平板對峙法篩選拮抗菌.【結(jié)果和結(jié)論】篩選出對人參單一病原菌有高拮抗活性的放線菌7株，對人參疫病、菌核病、灰霉病、黑斑病、銹腐病、立枯病、根腐病拮抗率分別為80.84%、82.46%、66.08%、71.33%、64.63%、85.53%、65.11%，其中對7大人參病害均有高拮抗活性的菌株有5株，包括1株木霉菌、4株放線菌.研究結(jié)果表明，可利用人參根際土壤中的有益菌研究其生防潛力，用于人參主要病害的防治.

菌株篩選； 拮抗菌； 人參; 病原菌； 根際微生物

人參PanaxginsengC. A. Mey為五加科名貴中藥材，需要種植5～6年才能收獲.人參病害主要以根部病害為主，也伴有一些地上莖葉的病害，根部病害發(fā)病率20%左右，重者高達70%以上，嚴重影響了人參的產(chǎn)量和品質(zhì)，削弱了我國人參產(chǎn)品在國際市場上的競爭力[1].目前我國人參病害主要依靠化學殺菌劑防治，殺菌劑在土壤中的有效期為1個月左右，容易造成化學農(nóng)藥污染.利用微生物拮抗菌株防治人參病害可以1次施用，多年有效，對人參和周邊環(huán)境不會造成化學殘留，是人參病害防治的發(fā)展方向[2-5].

我國在人參病害拮抗菌篩選方面做了較多工作，得到了一些對人參病害有拮抗作用的有益菌株[6]，并且取得了較好的防治效果[7- 8]，但是，這些拮抗菌大多數(shù)只作用于1種人參病害、或是同時作用于2～3種人參病害，不能滿足實際防治需要，防治效果也不很理想.本試驗從我國人參主產(chǎn)區(qū)的人參根際土壤中進行了大量拮抗菌的篩選，以期分離出拮抗效果更好、抑菌譜更廣、同時對7大人參主要病害有抑制作用的優(yōu)良菌株，從而擴大生防菌種資源，為開發(fā)防治人參病害殺菌劑提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：放線菌的分離培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基；木霉菌的分離培養(yǎng)采用孟加拉紅培養(yǎng)基；拮抗菌篩選采用PDA培養(yǎng)基.

人參病原菌：疫病菌Phytophthoracactorum、菌核菌Sclerotiniaschinseng、灰霉菌BotrytiscinereaPers、黑斑菌Alternariapanax、銹腐菌Cylindrocarpondestructans、立枯菌Rhizoctoniasolani、根腐菌Fusariumsolani，由吉林農(nóng)業(yè)大學人參研究工程中心實驗室提供.

土樣：集安(3、4、5年生)、靖宇(4、5年生)、撫松(4、5、6年生)、長白(5、6、7年生)等人參主產(chǎn)地的不同年生人參根際土壤，2次采樣時間分別為2012年5月和9月，共采集土樣58份，4℃冰箱保存?zhèn)溆?

木霉菌：sTHB和sTV04，由吉林農(nóng)業(yè)大學人參研究工程中心實驗室提供.

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離 采用稀釋平板法對土壤中的微生物進行分離，取0.5 mL相應(yīng)稀釋濃度的菌懸液用涂布棒分別涂到對應(yīng)的培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取不同形態(tài)的單菌落，純化后保存.其中，木霉菌稀釋度為10-3、10-4、10-5，25 ℃培養(yǎng)24～48 h；放線菌的稀釋度為10-3、10-4、10-5,28 ℃培養(yǎng)48～72 h；每個稀釋度重復(fù)3次.

1.2.2 拮抗放線菌的篩選 將人參病原菌用打孔器制成直徑為5 mm的菌塊接種于中心，挑取放線菌在距離中心等距離的兩側(cè)劃線.以只接病原菌的PDA平板作為對照，每處理重復(fù)3次.28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，初步篩選出對人參病原菌有拮抗作用的菌株，將這些拮抗菌株純化，保存，待測.

1.2.3 拮抗木霉菌的篩選 將人參病原菌和拮抗菌株分別用打孔器制成直徑為5 mm的菌塊，并將人參病原菌和拮抗菌分別接種于距中心等距離的PDA平板的兩側(cè).以只接病原菌的PDA平板作為對照，每處理重復(fù)3次.25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，初步篩選出對人參病原菌有拮抗作用的菌株，將這些拮抗菌株純化、保存、待測.

1.2.4 拮抗放線菌的抑菌活性測定 將有抑菌作用的拮抗菌株做進一步篩選.在PDA培養(yǎng)皿中心接種培養(yǎng)48 h的人參病原菌菌餅(直徑5 mm)，用接種針蘸取培養(yǎng)48 h的拮抗菌，以病原菌菌餅為中心，在PDA培養(yǎng)基上劃等邊三角形，這3條細線的豎行作為3次重復(fù)數(shù)據(jù)，以只接種病原菌的PDA平板為對照，28 ℃培養(yǎng)72～96 h左右，待對照接近長滿培養(yǎng)皿時，用游標卡尺測量各個培養(yǎng)皿中人參病原菌的菌落生長半徑，按下面公式計算拮抗率：

拮抗率=(對照病原菌凈生長半徑-拮抗菌作用后的病原菌凈生長半徑)/對照病原菌凈生長半徑×100%.

1.2.5 拮抗木霉菌抑菌活性測定 采用兩點對峙法(方法同1.2.2)，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～84 h后，待對照接近長滿平板時，用游標卡尺測量各個培養(yǎng)皿中人參病原菌的菌落生長半徑，計算拮抗率.

1.3 數(shù)據(jù)分析

Excel 2003錄入數(shù)據(jù)，DPS 7.05軟件進行方差分析，LSD法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和對7種人參病原菌的拮抗作用

從土壤中分離得到226株放線菌、35株木霉菌，其中篩選出有拮抗作用的放線菌25株、木霉菌8株.而其余的201株放線菌和27株木霉菌沒有拮抗作用(表1).

表1拮抗菌對人參疫病、菌核、灰霉、黑斑病、銹腐、立枯、根腐病病原菌的拮抗率

Tab.1TheantagonisticrateofantagonisticstrainsonpathogensofPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,Cylindrocarpondestructans,RhizoctoniasolaniandFusariumsolani

1)首字母A、B為放線菌；首字母m為木霉菌.

對人參疫病病原菌有拮抗作用的放線菌有21株、木霉菌5株；拮抗率均達到40%以上.放線菌A-A- 26-1對其拮抗率最高(80.84%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(78.68%).對人參菌核病病原菌有拮抗作用的放線菌有9株、木霉菌1株；拮抗率達到40%以上.放線菌A-34對其拮抗率最高(82.46%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(41.39%).對人參灰霉病病原菌有拮抗作用的放線菌有8株、木霉菌1株；拮抗率達到10%以上.放線菌A-38對其拮抗率最高(66.08%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(71.76%).對人參黑斑病病原菌有拮抗作用的放線菌有23株、木霉菌1株；拮抗率達到30%以上.放線菌B- 4對其拮抗率最高(71.33%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(71.76%).對人參銹腐病病原菌有拮抗作用的放線菌有22株、木霉菌6株；拮抗率達到10%以上，放線菌A-30對其拮抗率最高(64.63%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(80.56%).對人參立枯病病原菌有拮抗作用的放線菌有5株、木霉菌1株；拮抗率達到50%以上，A- 47對其的拮抗率最高(85.53.%)；木霉菌mB153對其拮抗率最高(76.90%).對人參根腐病病原菌有拮抗作用的放線菌有28株、木霉菌2株；拮抗率達到10%以上，B-11- 45對其拮抗率最高(65.11%)；木霉菌mA-11對其拮抗率最高(49.81%).

2.2 拮抗菌株對7種人參病原菌的拮抗活性測定

4株高活性拮抗放線菌A-38、A-34、A-39、A- 47(表2、圖1)和1株高活性拮抗木霉菌株mB153(圖2)均同時對7種人參病原菌有較高的拮抗作用.其中，對人參疫病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A-39(71.0%)；對人參菌核病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A-34(82.4%)；對人參灰霉病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A-38(66.0%)；對人參黑斑病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A- 47(65.3%)；對人參銹腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A- 47(48.2%)；對人參立枯病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A- 47(85.5%)；對人參根腐病病原菌拮抗率最高的拮抗菌株是放線菌A-38(59.6%)；A- 25、A-30、A- 61、A-50、A-19拮抗放線菌同時對2種及2種以上的人參病原菌有不同程度的抑制作用.

表2 拮抗放線菌對7種人參病原菌的抑制作用1)Tab.2 The inhibition of antagonistic activity of Actinomyces on 7 ginseng pathogens %

1) 同行數(shù)據(jù)后凡具有一個相同小寫字母者表示差異不顯著(P>0.05，LSD法).

a、b分別表示放線菌A- 47和A-39對人參黑斑病病原菌的拮抗效果；c：放線菌A-38對人參根腐病病原菌的拮抗效果；d：放線菌A-34對人參疫病病原菌的拮抗效果.

圖1 高活性菌株對人參病原菌的拮抗作用
Fig.1 Antagonistic effects of high activity strains on pathogens of ginseng

a、b、c、d分別表示木霉mB153對人參銹腐病、人參黑斑病、人參菌核病、人參根腐病病原菌的拮抗效果.

圖2 高活性拮抗木霉mB153對人參病原菌的拮抗效果

Fig.2 The antagonistic effect of a high antagonistic activityTrichodermamB153 on ginseng pathogens

3 討論與結(jié)論

人參病害從發(fā)生部位可以分為地上、表土中和地下部位.黑斑病、疫病、灰霉病屬于地上部位病害，立枯病屬于表土中的病害，銹腐病、根腐病、菌核病都屬于根部病害[9].邢云章等[10]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉菌對人參根腐病病原菌有抑制作用，本試驗篩選出1株綠色木霉菌mB153對人參根腐病病原菌也有抑制作用.王慧等[11]從79 株木霉菌株中篩選出3株對人參銹腐病病原菌拮抗效果較好的菌株WCT- 01、WWZ22-11和Z- 67，3株木霉菌抑制率分別達到77.24%、76.08%和74.06%.ECT- 01- 2對人參銹腐病病原菌的抑制率高達83.68%[12].而本試驗篩選的高活性木霉菌株(mB153)對人參銹腐病病原菌的抑制率達到80.56%.崔立萍等[13]研究篩選的5株拮抗菌對人參黑斑病病原菌的抑菌率達到70%～80%，而本試驗篩選得到的4株高活性拮抗放線菌(A-38、A-34、A-39、A- 47)、1株木霉(mB153)對人參黑斑病、人參銹腐病的抑制率均達到50%和38%以上，而且這5株高活性拮抗放線菌均對7大人參主要病害有較高的拮抗作用，與前人的研究相比較，這5株高活性拮抗菌的抑菌譜更寬，能同時降低多種人參病害的發(fā)生率，更能滿足人參多種病害同時發(fā)生的實際防治需要，具有巨大的應(yīng)用開發(fā)潛力.研究[14-16]發(fā)現(xiàn)一些有益綠色木霉、細菌的拮抗菌株同時對人參銹腐病、立枯病、疫病、黑斑病、灰霉病、根腐病、菌核病等常見人參病害有較高拮抗作用，但本試驗篩選的拮抗菌的抑菌譜更寬.本試驗篩選出的拮抗放線菌數(shù)量更多，而木霉菌拮抗率更高.

從微生物農(nóng)藥的成分上來看，單一的微生物殺菌劑的拮抗效果往往不好，表現(xiàn)在定植效果不好和使得病原菌產(chǎn)生抗性等方面；而采用復(fù)配、多種拮抗菌劑混合、添加有機添加劑[17]等方式更符合人參病害防治的實際需要.本試驗中篩選的拮抗木霉菌株mB153對7大人參病害均有不同程度抑制作用，其中對人參銹腐病病原菌的拮抗率最高為：80.56%，對菌核病病原菌的拮抗率最低為：41.39%，對其他5種人參病原菌的拮抗率達41.39%～80.56%.供試木霉菌株sTHB對7大人參病害均有不同程度拮抗作用，對人參黑斑病病原菌的拮抗率最高為：83.58%，對人參菌核病病原菌的拮抗率最低為：53.83%，對其他5種人參病原菌的拮抗率均在53.83%～83.58%.供試木霉菌株sTV04對人參銹腐病病原菌拮抗率最高為：84.67%，對人參菌核病病原菌的拮抗率最低為48.35%，但對人參疫病病原菌無抑制作用，而對其他4種人參病原菌的拮抗率均在48.35%～84.67%.本試驗篩選出的拮抗菌株mB153對人參病原菌的拮抗率雖然低于實驗室供試菌株，但是仍然具有一定的應(yīng)用防效價值.研究發(fā)現(xiàn)實驗室保存的木霉菌sTHB、sTV04和本試驗篩選的拮抗木霉菌株mB153對人參菌核病病原菌均表現(xiàn)出最低的拮抗率，可以考慮將3種木霉菌制成混合劑型的微生物殺菌劑，以期能更好的防治人參菌核病.本試驗的拮抗菌均分離自人參根際土壤，這一點，對于后續(xù)菌株的定植會占有一定優(yōu)勢，這與Timmusk等[18]研究結(jié)果是類似的，因此具有很好的研究和開發(fā)前景.關(guān)于拮抗菌株的鑒定、生防制劑、抗菌活性物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及生防菌株的混合使用技術(shù)還需要進一步研究.

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【責任編輯霍 歡】

ScreeningantagonisticmicroorganismsagainstginsengdiseasesfromPanaxginsengrhizospheresoil

QIANG Wei, GUO Shuai, ZHANG Aihua, LEI Fengjie, CHI Kun, WANG Zhuang, WANG Erhuan, ZHANG Lianxue

(College of Chinese Traditional Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

【Objective】 To expand biocontrol strain resources and screen new strains with a higher antagonistic rate and a wider inhibiting range to control ginseng diseases. 【Method】 The antagonistic strains were isolated by dilution plate method and were screened by flat-stand method.【Result and conclusion】 Seven actinomycetes strains with higher antagonistic activities to single ginseng pathogen, such asPhytophthoracactorum,Sclerotiniaschinseng,Botrytiscinerea,Alternariapanax,CylindrocarpondestructansRhizoctoniasolaniandFusariumsolani, had been screened, whose inhibition rates were 80.84%, 82.46%, 66.08%, 71.33%, 64.63%, 85.53% and 65.11%, respectively. Five strains, including a strain ofTrichodermaand four strains ofActinomyces, had higher antagonistic activities to seven kinds of ginseng pathogens. The results indicate that the beneficial strains in the rhizosphere has a biocontrol potential ability of ginseng pathogens and can be used to prevent and cure major diseases of ginseng.

screen strains; antagonist strain; ginseng; pathogen; rhizosphere microbial

2013- 11- 28優(yōu)先出版時間2014- 07- 17

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20140717.0907.014.html

強 薇(1986—)，女，碩士研究生，E-mail: 1263785469@qq.com：通信作者：張連學(1955—)，男，教授，博士，E-mail: zlx863@163.com

國家自然科學基金(31070316，31100239，31200224); 國家“十一五”科技支撐計劃子課題(2006BA109804- 02)； 國家公益性行業(yè)科研專項(201303111)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20110926，20130206030YY)

強 薇，郭 帥，張愛華，等.人參根際土壤中拮抗人參病害微生物的篩選[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014,35(5):76- 81.

S482.292

A

1001- 411X(2014)05- 0076- 06