陳果亮，余興龍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南美神育種有限公司，湖南 株洲 412007)

豬瘟病毒弱毒C株ST細胞傳代疫苗對仔豬的免疫效果

陳果亮1,2，余興龍1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南美神育種有限公司，湖南 株洲 412007)

將豬瘟病毒弱毒C株ST細胞苗以不同劑量(106TCID50和105TCID50)免疫28日齡仔豬，通過臨床癥狀觀察、病理剖檢和組織病理學(xué)觀察、抗體檢測、特異性淋巴細胞增殖試驗及抗原檢測等方法評價疫苗免疫效果。結(jié)果表明：該疫苗接種仔豬后無任何臨床癥狀，無病毒血癥，無排毒現(xiàn)象；不同劑量免疫組，在2免后10 d左右豬瘟特異性抗體陽轉(zhuǎn)，抗體水平于2免后 20 d左右達到峰值。以上結(jié)果表明，豬瘟弱毒疫苗毒株C株的ST細胞傳代疫苗對仔豬安全有效。

豬瘟病毒；C株；ST細胞；免疫效果

1 材料和方法

1.1 供試豬與疫苗

供試豬為18 頭28日齡左右仔豬，經(jīng)IDEXX豬瘟抗體檢測試劑盒檢測為CSFV抗體陰性，購自無CSFV豬場。將CSFV兔化弱毒C株(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子與免疫實驗室傳代保存)接種ST細胞并傳代培養(yǎng)，收毒后測定病毒滴度，作為接種用C株ST細胞疫苗。

1.2 免疫試驗

18 頭仔豬隨機分為高劑量免疫組、低劑量免疫組和對照組，每組 6頭。免疫分1次免疫(首免)和2次免疫(加強免疫)，高、低劑量免疫組分別經(jīng)頸部肌肉注射1 mL含106TCID50和含105TCID50病毒的C 株ST細胞疫苗，對照組注射ST細胞培養(yǎng)液1 mL；首免后21 d進行加強免疫。免疫前7 d及免疫后每3 d對試驗組進行前腔靜脈采血：采非抗凝血分離血清，用于抗體檢測；免疫后每隔3 d采集抗凝血、肛拭子、鼻拭子，用于核酸檢測。

1.3 抗體檢測

用 IDEXX 公司 CSFV抗體檢測試劑盒檢測血清中的 CSFV 特異性中和抗體。

1.4 臨床觀察與剖檢和樣品采集

首免后，每天記錄各組仔豬的直腸溫度和臨床變化，連續(xù)監(jiān)測7 d。所有仔豬在2免后24 d處死并進行病理剖檢，采集扁桃體、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)用于淋巴細胞增殖試驗、組織病理學(xué)檢查及病原學(xué)檢測。

1.5 細胞免疫應(yīng)答檢測

分離脾臟的淋巴細胞，根據(jù)文獻[4]的CFSE法檢測淋巴細胞增殖能力。

1.6 組織病理學(xué)和病原學(xué)檢查

根據(jù)參考文獻[4]的方法對扁桃體、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)進行石蠟切片的制作，并進行組織病理學(xué)觀察。根據(jù) CSFV 石門株的基因序列(序列的GenBank登錄號為AF092448)設(shè)計1對CSFV特異性引物，用于CSFV核酸的檢測，上游引物序列為5′– CGGTTAGGGAG GAGTACGCA–3′，下游引物序列為5′–TGATGCTG TCACACAGGTGAA–3′。用TRIzol 試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)分別提取抗凝血、肛拭子、鼻拭子、扁桃體、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)的總RNA，溶于20 μL DEPC處理的滅菌雙蒸水中，取 2 μL RNA，采用大連寶生物One–step RT–PCR試劑盒進行擴增，以檢測CSFV核酸。擴增體系按說明書進行配置。反應(yīng)程序為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min 94 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶2 min，35個循環(huán)(94 ℃預(yù)變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min)，最后72℃總延伸 7 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 CSFV特異性中和抗體檢測結(jié)果

高劑量和低劑量免疫組在2次免疫后 10 d左右，CSFV特異性抗體開始轉(zhuǎn)陽，之后抗體水平持續(xù)升高，并于加強免疫后20 d左右達到峰值，隨后有所降低，2個免疫組的抗體水平的變化基本一致而對照組CSFV特異性抗體一直為陰性(圖1)。

圖1 ELISA檢測CSFV特異性中和抗體Fig. 1 Detection of CSFV specific antibody titers by ELISA

圖2 T淋巴細胞增殖效率檢測Fig. 2 Detection of T lymphocyte cells proliferation

2.2 特異性淋巴細胞增殖結(jié)果

用 CFSE染色方法評價了免疫豬 CD8+和CD4+T 細胞經(jīng)CSFV抗原刺激后的增殖反應(yīng)。結(jié)果表明，CSFV C株 ST細胞苗免疫豬的脾細胞經(jīng)CSFV C株體外刺激后誘導(dǎo)了平均 5.2%～6.7%的CD4+T 細胞增殖和4.8%～6.8%的 CD8+T 細胞增殖，而對照組沒有產(chǎn)生任何特異性淋巴細胞增殖，差異極顯著(P＜ 0.01) (圖2)。

2.3 臨床及病理解剖檢驗結(jié)果

對照組和CSFV C株ST細胞疫苗免疫的豬沒有出現(xiàn)任何異常臨床癥狀，體溫(38.5～39.5 ℃)正常，病理剖檢眼睛觀察未見明顯病理變化。

2.4 組織病理學(xué)觀察結(jié)果

石蠟切片檢查結(jié)果表明，免疫組和對照組的扁桃體、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)沒有出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化(圖3)。

圖3 組織病理學(xué)觀察Fig. 3 Tissue pathology observation

2.5 病毒血癥、肛拭子、鼻拭子及臟器病毒核酸的檢測

用RT–PCR 檢測免疫豬免疫后3、6、9 d的血液的病毒核酸。結(jié)果表明，免疫后9 d內(nèi)仔豬體內(nèi)均無病毒血癥檢出。將所有豬的肛拭子和鼻拭子進行CSFV的核酸檢測，結(jié)果免疫組和對照組均無病毒排出。對所有豬的脾臟、腹股溝淋巴結(jié)及扁桃體進行檢測發(fā)現(xiàn)，免疫組和對照組豬的臟器中均無CSFV核酸檢出。

3 討 論

本研究中，用不同劑量CSFV C株ST細胞疫苗免疫的仔豬，其體溫均未出現(xiàn)異常，也沒明顯的臨床癥狀。免疫后，在豬體內(nèi)無病毒血癥且不排毒這與其他研究[5,6]用不同培養(yǎng)體系制備的CSFV C株疫苗免疫豬體后也不往外排毒的結(jié)果一致。C株ST細胞疫苗免疫后的豬，各臟器均無明顯病理學(xué)變化，且未檢查到CSFV特異性核酸，表明CSFV C 株ST細胞疫苗對仔豬十分安全。

CSFV C株ST細胞疫苗不同劑量接種仔豬后21 d內(nèi)抗體基本呈陰性，在第21天加強免疫后不久抗體轉(zhuǎn)陽，且持續(xù)升高，表明該疫苗能刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，這一結(jié)果與張平[1]等人的報道一致，即目前市售商品化疫苗首次免疫后21 d內(nèi)

基本檢測不到CSFV特異性抗體，必須加強免疫一次才能有顯著的抗體升高，同時也提示如果僅拿抗體水平來評價臨床免疫效果，需在2免后進行。免疫后的豬脾臟中的CD8+和CD4+T細胞經(jīng)特異性抗原刺激能產(chǎn)生特異性的增殖，表明免疫C株ST細胞疫苗后，可同時誘導(dǎo)豬產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫。有研究[7–9]指出，細胞免疫可能在早期免疫中提供免疫保護，因此，在臨床評價豬瘟弱毒疫苗免疫效果時應(yīng)該加強豬群特異性細胞免疫方面的檢測。

[1] 張平，孫惠玲，孫繼國．5種商品化豬瘟疫苗免疫豬后的抗體水平監(jiān)測比較[J]．動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31(10)：113–115．

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Immuno-efficacy of classcical swine fever virus C strain propagated in ST cells on piglets

CHEN Guo-liang1,2, YU Xing-long1*
(1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Meishen Breeding Co.,Ltd., Zhuzhou, Hunan 412007, China)

Twenty-eight day-old piglets were inoculated with classical swine fever virus (CSFV) attenuated C strain propagated in ST cells at different doses (106TCID50and 105TCID50). The immuno-efficacy was evaluated by clinical symptoms, pathologic autopsy and histopathology, antibody detection, lymphocyte proliferation assay and antigen detection. The results showed that this C strain induced no observed clinical symptom, no viremia, no virus shedding. An identical booster immunization was conducted 3 weeks post primary immunization，about 10 days after the second immunization, the CSFV specific antibody changed to be positive and the level of which arrived at a peak 20 days after the second immunization. In conclusion, the CSFV C strain propagated in ST cells is safe and efficiency to the piglets.

classical swine fever virus; C strain; ST cell; immuno-efficacy

10.13331/j.cnki.jhau.2014.01.014

時間：2014– – 00:00

網(wǎng)絡(luò)出版地址：

S852.65+1

A

1007?1032(2014)01?0065?04

中國于 20 世紀 50 年代首先研發(fā)出了舉世聞名的豬瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)。根據(jù)疫苗制造工藝的不同，C株弱毒疫苗分組織苗(乳兔組織苗、牛體反應(yīng)組織苗)和細胞苗(豬睪丸細胞(ST)苗)。目前，2種疫苗的使用都很普遍[1–2]。但C株ST細胞苗對仔豬的免疫效果在國內(nèi)尚缺乏臨床試驗報道，且該疫苗在臨床應(yīng)用過程中應(yīng)該采取怎樣的免疫程序也沒有明確的科學(xué)依據(jù)。目前，多數(shù)集約化養(yǎng)殖場仍采取了多次免疫接種，如21日齡首免和65日齡加強免疫的免疫程序[3]。筆者用 ST細胞培養(yǎng)CSFV兔化弱毒C株，傳代馴化后采用2種劑量免疫仔豬，探尋疫苗的安全性及抗體消長規(guī)律，以期為臨床制定CSFV兔化弱毒C株ST細胞苗的免疫程序提供參考依據(jù)。

2013–04–12

湖南省科技重大專項(2007FJ1003)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)人才引進基金(04YJ03)

陳果亮(1981—)，男，湖南湘潭人，博士研究生，主要從事動物傳染病學(xué)研究，446443800@qq.com；*通信作者，xlyu999@ yahoo.com.cn