薛英杰 谷麗平

·論著·

p-Akt和CDK2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌新輔助化療的相關(guān)性研究

薛英杰 谷麗平

目的探討不同類型癌癥中蛋白激酶B(Akt，又稱PKB)、周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)與非小細(xì)胞肺癌新輔助化療之間的相關(guān)關(guān)系，為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后判斷及治療提供依據(jù)和指導(dǎo)。方法收集2010年9月至2012年6月收治的120例非小細(xì)胞肺癌患者中選出80例非小細(xì)胞肺癌患者，以新輔助化療前穿刺活檢病理組織為對照組，試驗(yàn)組為順鉑聯(lián)合紫杉醇組， 80例患者均為進(jìn)行新輔助化療2周期后再行手術(shù)的患者。病理標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)及逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測pAkt和CDK2在新輔助化療前及手術(shù)后的表達(dá)變化情況。進(jìn)一步分析AKT、CDK2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌化療效果之間的相關(guān)性。結(jié)果新輔助化療能有效殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術(shù)的切除率。免疫組織化學(xué)SP法染色表明，新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組P-Akt表達(dá)均低于新輔助化療前(P<0.05)。提示pAkt、CDK2表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，pAkt、CDK2表達(dá)降低(P<0.05)。逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表達(dá)新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組AktRNA的表達(dá)低于新輔助化療前，CDK2RNA的表達(dá)均明顯低于新輔助化療前(P<0.05)。提示AktRNA、CDK2RNA的表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，AktRNA、CDK2RNA的表達(dá)降低。結(jié)論新輔助化療能有效殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術(shù)的切除率。AKT和CDK2作為參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的重要基因。新輔助化療能有效降低腫瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表達(dá)，且隨化療療程延長及患者聯(lián)合化療的應(yīng)用，AKT基因表達(dá)降低，CDK2基因表達(dá)的降低更為明顯。

p-Akt，CDK；非小細(xì)胞肺癌；新輔助化療

近十年來，肺癌的發(fā)病率及死亡率都位居全球之首，世界衛(wèi)生組織預(yù)測，我國將成為世界第一肺癌大國，此外，肺癌尚缺乏有效的早診早治手段，總的5年生存率低于10%。因此，無論從發(fā)病率、死亡率還是預(yù)后看，肺癌都是嚴(yán)重威脅人民健康和生命的疾病，已經(jīng)是我國第一大癌癥，成為我國新世紀(jì)癌癥防治的難中之難，重中之重。在臨床工作中，肺癌的病理類型以非小細(xì)胞肺癌居多，而小細(xì)胞肺癌較少。在非小細(xì)胞肺癌中鱗癌和腺癌多見。肺癌的起病隱匿，許多患者在診斷明確時(shí)常發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。前人研究表明，對于中晚期非小細(xì)胞肺癌患者，起初不能手術(shù)切除的患者經(jīng)過新輔助化療后腫瘤組織縮小，可進(jìn)行手術(shù)切除治療。提高了患者進(jìn)行手術(shù)切除的幾率。從而提高患者的生存率和治療有效率。本試驗(yàn)通過在手術(shù)前后分別取腫瘤組織標(biāo)本研究新輔助化療對患者病理組織中蛋白激酶B(Akt又稱PKB)、周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較和分析，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院病理科2010年9月至2012年6月非小細(xì)胞肺癌患者石蠟包埋組織160塊，其中包括80例化療前和80例術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本石蠟包埋組織。80例非小細(xì)胞肺癌患者，均為男性吸煙患者。年齡40～70歲，平均年齡55歲，中位年齡62歲，分期為Ⅲ期。標(biāo)本的選取有可對照性，取材腫瘤大小一樣，先做新輔助化療使腫瘤縮小后有利于手術(shù)的開展。

1.2 分組及化療 選取鱗癌患者40例，腺癌患者40例。以新輔助化療前穿刺活檢病理組織為對照組，順鉑聯(lián)合紫杉醇組為試驗(yàn)組，其中順鉑按70 mg/m2，紫杉醇按175 mg/m2計(jì)算使用。80例患者均為進(jìn)行新輔助化療2周期后再行手術(shù)。

1.3 新輔助化療方法 (1)新輔助化療前評估患者在入選前詳細(xì)詢問病史并進(jìn)行細(xì)致的查體。然后進(jìn)行分期檢查，包括頭部MRI、胸部CT、腹部彩超、淺表淋巴結(jié)彩超、全身骨掃描。實(shí)驗(yàn)室檢查包括血、尿、便常規(guī)，肝腎功、血糖、電解質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物檢查。(2)新輔助化療后療效及評價(jià)方法：療效：兩個(gè)最大垂徑乘積變化；CR：全部病灶消失，至少維持4周；PR：縮小至少50%，至少維持4周；NC/SD：介于PR 和PD之間；PD：增加超過25%,或出現(xiàn)新病灶。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)SP法染色：對非小細(xì)胞肺癌患者p-AKT和CDK2采取免疫組織化學(xué)法染色，即采用抗體與抗原特異性結(jié)合顯色的方法，檢測CDK2及p-AKT蛋白質(zhì)表達(dá)狀況。判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組織化學(xué)結(jié)果應(yīng)用IPP圖文分析軟件分析。細(xì)胞胞漿中有棕黃色顆粒為陽性信號，每個(gè)標(biāo)本切片取10個(gè)高倍視野(400倍),綜合陽性面積和染色深度計(jì)算陽性區(qū)域的光密度值(IOD)，以各組的均值進(jìn)行比較[2]。

1.4.2 另一種方法采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療對非小細(xì)胞肺癌療效的觀察 80例病例中2周期化療后完全緩解為3.75%(3/80)；部分緩解為35.00%(28/80)；臨床穩(wěn)定為42.50%(34/80)；臨床進(jìn)展為18.75%(15/80)。經(jīng)新輔助化療后部分患者的腫瘤體積變小，可順利進(jìn)行手術(shù)治療。

2.2 新輔助化療對非小細(xì)胞肺癌p-AKT蛋白表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)SP法染色表明，P-AKT主要在胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。表現(xiàn)為出現(xiàn)棕黃色顆粒。新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組P-Akt表達(dá)(0.59±0.09)均低于新輔助化療前(0.78±0.10)(P<0.05)。提示pAkt表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，pAkt表達(dá)降低(P<0.05)。

2.3 新輔助化療對非小細(xì)胞肺癌CDK2蛋白表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)SP法染色表明，CDK2主要在胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組CDK2表達(dá)(0.37±0.06)均明顯低于新輔助化療前(0.84±0.09)(P<0.05)。提示CDK2表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，CDK2表達(dá)降低(P<0.05)。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表達(dá) 新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組AktRNA的表達(dá)均明顯低于新輔助化療前(P<0.05)。提示AktRNA的表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，AktRNA的表達(dá)降低(P<0.05)。新輔助化療二周期順鉑聯(lián)合紫杉醇組CDK2RNA的表達(dá)均明顯低于新輔助化療前。提示CDK2RNA的表達(dá)與化療療程負(fù)相關(guān)，隨化療時(shí)間的延長，CDK2RNA的表達(dá)降低(P<0.05)。

3 討論

近年來，大量研究表明AKT在肺癌信號通路中起重要的調(diào)控作用[1]。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidy linositol-3 kinase,PI-3K)可受多種生長因子激活，為生長因子家族的重要成員。活化的PI3K可以使PIP2變?yōu)镻IP3，PIP3可以激活磷脂酰肌醇依賴性酶1(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，后者可以使AKT活化。PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化，避免發(fā)生細(xì)胞凋亡。絕大多數(shù)抗腫瘤藥物都是通過誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而殺死腫瘤細(xì)胞。通過藥物降低AKT的活化水平能夠增加腫瘤細(xì)胞對于化療藥物的敏感性[2]。

基于AKT的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)選擇AKT抑制劑，主要分為如下三種：ATP競爭性抑制劑、PH結(jié)構(gòu)抑制劑、變構(gòu)抑制劑和底物類似物。GSK690693是一種ATP競爭性抑制劑，在低濃度時(shí)對AKT的3中亞型均可抑制，降低下游分子的磷酸化水平。并能增強(qiáng)RB1和FOX01/3的活性，從而抑制Myc和TFRC的活性。缺點(diǎn)是這種抑制劑對所有AGC家族蛋白質(zhì)均有抑制作用，特異性不強(qiáng)。PH結(jié)構(gòu)抑制劑：派立福新是一種烷基磷脂類抗癌藥物，降低AKT的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞及誘導(dǎo)凋亡，增加其他化療藥物的敏感性[4]。

Akt促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移?；罨腁KT通過多種途徑調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase，eNOS)、MMP2及Ps6k等。eNOS促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移[5]。

CDK2在細(xì)胞周期中作為正向調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞的演變、增殖、分化有關(guān)，是原癌基因的一種。CDK2蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。對宣威地區(qū)非小細(xì)胞肺癌研究表明CDK2在宣威地區(qū)的鱗癌和腺癌中的表達(dá)均高于正常的組織。且該蛋白與非小細(xì)胞肺癌臨床分期和組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。CDK2的表達(dá)與P27kip1表達(dá)負(fù)相關(guān)(P<0.05)[6]。

本研究通過對80例非小細(xì)胞肺癌患者的病理切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察p-Akt、CDK表達(dá)和非小細(xì)胞肺癌化療之間的相關(guān)性。首先研究Ⅲ期鱗癌和腺癌患者在化療前穿刺組織的表達(dá)情況，然后研究2周期化療后p-Akt、CDK表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。

本研究中，我們觀察了新輔助化療前后所選病例病灶大小的變化，我們發(fā)現(xiàn)以上80例病例中， 2期化療后完全緩解為3.75%(3/80),部分緩解為35.00%(28/80),臨床穩(wěn)定為30.00%(34/80)，臨床進(jìn)展為18.75%(15/80)。經(jīng)新輔助化療后一部分患者的腫瘤變小，順利的進(jìn)行了手術(shù)治療。

然后，我們用免疫組織化學(xué)的檢測方法，檢測化療前、2周期化療后p-Akt、CDK表達(dá)水平，結(jié)果顯示P-Akt表達(dá)水平與患者化療藥物負(fù)相關(guān)。隨著化療藥物使用，AKT表達(dá)水平逐步降低。二者對比差異顯著。免疫組織化學(xué)SP法染色表明，CDK2主要在胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)也有少量表達(dá)。CDK2表達(dá)水平也與患者使用化療藥物呈負(fù)相關(guān)，隨著化療藥物的使用，CDK2表達(dá)水平降低，患者在化療前后表達(dá)水平有顯著差異。這說明使P-AKT表達(dá)水平降低，聯(lián)合化療是有效的。新輔助化療使腫瘤組織縮小后有利于手術(shù)的開展，從而提高手術(shù)的成功率及患者的治療有效率。

綜上所述， 新輔助化療能有效殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術(shù)的切除率。AKT和CDK2作為參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的重要基因。新輔助化療能有效降低腫瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表達(dá)，且隨化療療程延長及患者聯(lián)合化療的應(yīng)用，AKT基因表達(dá)略降低，CDK2基因表達(dá)的降低明顯。

1 Carnero A.The PKB/AKT pathway in cancer.Curr Pharm Des,2010,16:34-44.

2 董自強(qiáng),江克華,宋興福,等.抑制PI3K/AKT信號通路提高膀胱癌化療效果的實(shí)驗(yàn)研究.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28:181-184.

3 張頤，伍丹丹，席紅，等.新輔助化療對晚期卵巢漿乳癌組織PI3K、P-AKT、PTEN表達(dá)的影響及臨床意義探討.山東醫(yī)藥,2009，49：76-77.

4 繆小輝,宋勇,呂鏜峰,等.AKT2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義.中國癌癥雜志,2011,21：396-399.

5 蒲絨,李為民,劉丹,等.AKT2及磷酸化AKT2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,41:586-589.

6 金文虎,王達(dá)利,聶開瑜,等.增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中CyclinD1，CDK2，CDK4作用及與細(xì)胞周期的相關(guān)性.中國組織工程研究,2012,16：4423-4426.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.014

073000 河北省定州市人民醫(yī)院腫瘤科(薛英杰);定州市人民醫(yī)院腎內(nèi)、內(nèi)分泌科(谷麗平)

R 734.2

A

1002-7386(2014)10-1478-03

2013-10-18)