項峰 任利萍 劉克勤 王曉云 張凡 陳江平 舒麗莎

·藥物研究·

子宮頸癌腫瘤干細(xì)胞篩選及體外敏感藥物試驗的臨床對比研究

項峰 任利萍 劉克勤 王曉云 張凡 陳江平 舒麗莎

MTT法；子宮頸癌；藥物篩選試驗；流式細(xì)胞術(shù)；腫瘤干細(xì)胞

子宮頸癌的輔助化療出現(xiàn)耐受導(dǎo)致化療失敗的病例常見，目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的存在可能導(dǎo)致腫瘤耐藥，CD133是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，在子宮頸癌的浸潤前沿分布密集，本實驗利用流式細(xì)胞術(shù)磁珠方法篩選腫瘤干細(xì)胞；同時利用體外藥物敏感性試驗對臨床常用的藥物譜進(jìn)行抗腫瘤藥物敏感性試驗，利用MTT比色法測定體外腫瘤藥敏的平均抑制率。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥物

1.1.1 儀器:酶標(biāo)儀(美國BIO-550 ),5%CO2培養(yǎng)箱，微量移液器(芬蘭，上海雷勃分析儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.1.2 抗腫瘤藥物:均從本院藥房領(lǐng)取，用生理鹽水(其中卡鉑、多柔比星、表柔比星需用注射用水)配制成實驗液，各種藥物的配制濃度分別為：多柔比星(ADM)0.4 mg/ml，表柔比星(e-ADM)0.8 mg/ml,順鉑(DDP) 1 mg/ml，卡鉑(CBP) 0.5 mg/ml,甲氨蝶呤(MTX) 0.1 mg/ml，長春新堿(VCR) 0.1 mg/ml,長春地辛(VDS) 40 mg/ml,長春瑞濱(NVB) 0.8 mg/ml，伊立替康(CPT-11) 0.8 mg/ml，拓?fù)涮婵?Topotecan) 0.1 mg/ml,依托泊苷(Vp-16) 1 mg/ml，替尼泊苷(VM-26)1 mg/ml,羥基喜樹堿(HCPT) 0.5 mg/ml，紫杉醇(Taxol) 0.5 mg/ml,吉西他濱(Gemzar) 3.33 mg/ml，博來霉素(BLM) 0.3 mg/ml，絲裂霉素(MMC)0.1 mg/ml，氟尿嘧啶(5-Fu)1 mg/ml。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠法分選子宮頸癌組織中的腫瘤干細(xì)胞:利用眼科剪剪取新鮮子宮頸癌腫瘤組織，剪碎后120目銅網(wǎng)規(guī)過濾，去紅細(xì)胞后制成腫瘤實質(zhì)組織的原代單細(xì)胞懸液，計數(shù)并重懸于1 ml 1% FBS-RPMI中，將50 μl已包被CD133一抗的磁珠與預(yù)冷細(xì)胞懸液1 ml混合，4℃孵育后將細(xì)胞懸液置于磁性顆粒分離器中3 min以上，依次收集含有CD133陽性細(xì)胞和CD133陰性細(xì)胞的分選液，將分選液離心，去上清液分別收集CD133+和CD133-細(xì)胞，PBS離心并洗滌后，用2×105活細(xì)胞/ml的濃度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增并傳代，依此獲取足量的CD133陽性細(xì)胞。

1.2.2 用MTT法對腫瘤細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行測定:分別收集CD133+和CD133-對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μl,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度1 000～10 000孔，5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入不同種類的藥物,每孔100 μl,5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μlMTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 每孔加入在酶聯(lián)免疫檢測儀150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。D490 nm處測量各孔的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 體外藥物敏感試驗顯示多種單藥的平均抑制率均大于20%，而臨床的有效率多數(shù)小于20%，兩者的差異在多數(shù)藥物都比較明顯(P<0.05)。見表1。

2.2 不同藥物對腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞平均抑制率的對比 多種藥物對腫瘤干細(xì)胞的敏感性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；少數(shù)藥物兩者抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell，TSC)是一群由正常干細(xì)胞經(jīng)演變發(fā)生基因異常表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，目前的研究顯示腫瘤干細(xì)胞的存在與多種腫瘤的多藥耐藥以及放療耐受相關(guān)。由于腫瘤干細(xì)胞具有極強的自身更新能力和經(jīng)常處于靜止期的特性，以及細(xì)胞膜高表達(dá)多種耐藥基因蛋白，便利其逃脫細(xì)胞毒藥物的殺傷作用，從而使腫瘤在化療后極易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞經(jīng)過基因突變的積累，獲得多藥耐藥機(jī)制并遺傳下來；或存在基因突變和分化異常導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤出現(xiàn)了多藥耐藥性；而且目前的化療藥物多數(shù)是細(xì)胞周期抑制劑，它們對經(jīng)常處于靜止期腫瘤干的消除無效[1]。因此本實驗利用流失細(xì)胞術(shù)分選子宮頸癌的原代腫瘤干細(xì)胞，培養(yǎng)后進(jìn)行常見臨床化療藥物的敏感性篩選，希望為子宮頸癌的個性化治療提供科學(xué)依據(jù)。

表1 體外藥物敏感試驗結(jié)果與臨床有效率比較

注：與臨床有效率比較，*P<0.05

表2 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞平均抑制率的對比分析 n=59，%

新輔助化療是子宮頸癌的有效的輔助治療方式，其主要通過縮小腫瘤原發(fā)灶和消除亞臨床轉(zhuǎn)移灶達(dá)到控制腫瘤發(fā)展，降低臨床分期，爭取手術(shù)機(jī)會，減少手術(shù)風(fēng)險的目的，但是腫瘤耐藥性的存在導(dǎo)致化療失敗，預(yù)后不佳。已有的研究顯示在多種腫瘤(包括口腔鱗癌、食管癌、乳腺癌等)存在腫瘤干細(xì)胞，并且分布較為集中的浸潤前沿細(xì)胞免疫表型具有其特殊性，此區(qū)域腫瘤細(xì)胞梭形變明顯，粘附性差，分化較低，對放化療抗拒，是局部復(fù)發(fā)和治療失敗的關(guān)鍵因素[2,3]。而CD133是目前公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可據(jù)此利用流式細(xì)胞儀將腫瘤干細(xì)胞從腫瘤組織中分離開來。在子宮頸癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞具有很強的自我更新和增殖能力，而CD133陰性細(xì)胞不分裂，不增殖。國內(nèi)的移植瘤研究發(fā)現(xiàn)：CD133陽性細(xì)胞體內(nèi)致瘤試驗具有較強的致瘤能力，而CD133陰性細(xì)胞無致瘤能力。另有研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的CD133陽性細(xì)胞可以長期保持未分化狀態(tài)。因此本實驗利用流式細(xì)胞儀將子宮頸癌的腫瘤干細(xì)胞分離并培養(yǎng)研究其與腫瘤細(xì)胞在耐藥性方面的差異，為篩選敏感藥物和制定個性化的化療方案提供依據(jù)。本實驗在體外敏感藥物篩選中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD133陽性細(xì)胞的耐藥性比例明顯高于腫瘤細(xì)胞，同時腫瘤干細(xì)胞在形態(tài)方面與腫瘤細(xì)胞相比亦存在明顯的差別，提示腫瘤干細(xì)胞通過細(xì)胞表型變化獲得耐藥性，同時通過細(xì)胞形態(tài)改變更具侵襲性。

腫瘤化療的個性化治療是未來治療的方向，而測試腫瘤藥物敏感性的試驗MTT比色法，方法簡單、快速、高效、靈敏，重復(fù)性較高，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于體外腫瘤藥敏的測定。此種體外篩選實驗對指導(dǎo)臨床治療和藥物的篩選具有明顯的指導(dǎo)意義。根據(jù)體外藥敏篩選試驗結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥，可以提高化療療效，提示盡可能減少交叉耐藥[4-6]。本實驗研究顯示體外敏感藥物和臨床的療效差異較大，而體外藥敏試驗陰性藥物臨床出現(xiàn)耐藥幾率較少，陰性準(zhǔn)確率較高，因而試驗結(jié)果對于化療前排除不敏感的抗腫瘤藥物非常有價值。同時體外篩選陽性藥物與臨床用藥的差異較大，推測其出現(xiàn)的主要原因在于體外腫瘤細(xì)胞生存與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的環(huán)境差別很大，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外微環(huán)境的相互作用，共同導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，但是體外敏感篩選試驗去除了機(jī)體免疫以及細(xì)胞外微環(huán)境對藥物的敏感性影響因素。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.058

075000 河北省張家口市，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

R 711.74

A

1002-7386(2014)02-0285-03

2013-10-18)